Ex vivo Culture de la drosophile pupes testicule et seul mâle kystes lignée germinale: Dissection, l'imagerie et le traitement pharmacologique

Le testicule chez les mâles de Drosophila est déjà formé dans l'embryon et persiste dans la cavité du corps pendant les stades larvaires. Troisième stade larvaire montrent de petits testicules rondes entourées d'une couche de futures cellules pigmentaires et intégrés dans le tissu de graisse corporelle (figure 2A). Les testicules chez les mouches mâles sont longs, des tubes enroulés, qui sont couvertes par une couche de cellules musculaires provenant du disque génital et une couche de pigment 24. Fait intéressant, les testicules larvaires ne contiennent que des cellules germinales de stades pré-méiotiques et méiose jusqu'au stade de spermatocytes primaires, ce qui correspond à la méiose (voir aussi la figure 1) 23. Les premières cohortes de cellules germinales mâles passent à travers la méiose pendant la formation du puparium. À environ 24 h APF, les étapes post-méiotiques avec flagelles allongée ont déjà mis au point, et tous les noyaux contenir histone H2AvD-DP (figures 1 et 2B). Aucun des spermatides ont subi til HP Commutateur aucun signal ProtamineB-eGFP peut être détecté par microscopie à fluorescence (figure 2C). Fréquemment, les testicules disséqués à ce stade contiennent une structure auto-fluorescent de taille variable qui rappelle un agglomérat de cellules du corps gras ou un de plusieurs gouttes d'huile (Figure 2C, tête de flèche). Cette structure à l'intérieur du testicule est également visible au microscope à contraste de phase. À ce jour, nous n'avons pas trouvé de description de la nature dans la littérature. Testicules disséqués à 36 h CSA apparaissent allongées et, dans certains cas commencent déjà à se courber (figure 2D). Ils ont déjà fixé aux tissus du tractus génital croissant à partir du disque imaginai 23,24 génitales. En outre, ils contiennent souvent les premières spermatides au-delà de l'interrupteur HP, comme indiqué par le signal ProtamineB-eGFP (figures 1 et 2D, flèche). A 48 heures CSA, les testicules ont encore allongé et clairement commencent curling à l'extrémité proximale. Plusieurs kystes lignée germinale avec des noyaux de protamine positif deviennent visibles (Figure 2E, flèche). Lorsque les testicules disséqués à 24 h APF sont maintenues en culture pendant 24 heures, ils ne s'allongent pas comme dans la mouche intact (comparer la figure 2D et 2E à la figure 6A). Ceci est probablement dû à un manque de signaux de position et de croissance normalement envoyées par l'appareil génital développement mise en contact du testicule à son extrémité postérieure 23,29. En outre, la couche musculaire de la gaine de testicules ne se développe pas parce que les myotubes naissants peuvent pas migrer à partir du disque génitale au testicule 24. La gaine dans cette situation testicule uniquement le pigment mince couche-ne semble pas se développer suffisamment dans la culture de l'enveloppe le nombre croissant de développer des cellules germinales au sein. Cependant, les cellules germinales croissent, se divisent, se différencient et indépendamment de la gaine du testicule. Ainsi, après plus de 36 hr dans la culture, au début des testicules sera souvent éclater, et le développement n'est pas observé. Cependant, dans un laps de temps plus court, il est possible d'enregistrer time-lapse ex vivo des images en direct de testicules entiers développement de la culture, comme en témoignent les figures 3A -3 C (voir également la vidéo supplémentaire 1). Un testicule pupe, disséqués à environ 45 h APF, a été incubé dans un milieu pendant 6 heures et imagée à toutes les 5 min. Dans ce laps de temps, plusieurs kystes de spermatides émergent de la scène de commutateurs HP et montrent un (3A Figures '-3 C, flèches ouvertes) lumineux signaux ProtamineB-eGFP. Comme mentionné ci-dessus, les cellules germinales mâles dans les testicules Drosophila développent comme des faisceaux synchronisés de cellules interconnectées, kystes nommés 1. Figure 4A montre un aperçu des kystes disséqués à partir d'un testicule de chrysalide à environ 24 h APF. Stades pré-méiotiques, Les étapes de la méiose, premiers stades post-méiotiques, et kystes aussi dans le stade précoce de canoë avec des noyaux allongés avant le commutateur HP peut être trouvé (figures 1 et 4B -4 E). Les kystes isolés sont très fragiles et doivent être manipulés avec précaution. Les deux cellules somatiques qui forment l'enveloppe du kyste peuvent être facilement perturbé mécaniquement. Les cellules souches de lignée germinale ont la capacité de survivre et de poursuivre la division après ablation génétique des cellules somatiques de kystes dans 30 vivo. Il a été rapporté que in vitro, les cellules germinales de l'étape 16 cellules séparées de leur enveloppe somatique développer et de se différencier de plus de 19. En effet, nous avons remarqué dans notre système de culture qui spermatocytes probablement fin complétées divisions méiotiques avec des cellules de kyste perturbé, bien que très rarement. Le plus souvent, ces kystes perturbé cessé développement. En suivant le protocole présenté, kystes intacts pourrait dans certains cas devElop ex vivo dans un milieu de culture pour un maximum de 72 heures. Cependant, nous avons observé qu'un nombre raisonnable de kystes survivre jusqu'à 48 heures d'incubation. Dans ce laps de temps, les kystes de culture sont capables de se développer à partir du stade de spermatocytes primaires qu'après divisions méiotiques ainsi que de la scène ronde de noyaux à chromatine base histone-jusqu'à la fin du stade de canoë-delà de la HP passer 12. Cela permet l'imagerie en direct des processus vitaux de la spermatogenèse, comme par exemple, les spermatocytes entrer divisions méiotiques (Figure 5 et vidéo supplémentaire 2). Pour cette expérience, le variant d'histone-DP H2AvD étiqueté a été utilisée comme marqueur chromosomique. Le stade de spermatocytes primaires s'étend sur env 3 jours in vivo 31. Par conséquent, afin d'enregistrer les divisions de la méiose, nous avons choisi des kystes avec spermatocytes qui avait visiblement ouvertes condensation de la chromatine (figure 5A, la région 2). Division de la méiose commence en spermatocytessur un côté du kyste et suit une vague dans les spermatocytes restants alors (figure 5A de la région 2 à la zone 1, voir aussi la vidéo supplémentaire 2). La condensation de la chromatine a tôt fait de chromosomes rapides qui sont visibles sous forme de taches lumineuses (figure 5A, la région 2). Après 30 min, les premiers spermatocytes de cette région sont déjà en telophase (Figure 5B, des pointes de flèches). Les chromosomes de la jeune une région à organiser la plaque métaphasique 20 min plus tard (Figure 5C). Ils télophase complète et sont prêts à subir la cytokinèse environ 15 minutes plus tard (Figure 5D). Anaphase, télophase et cytokinèse a duré environ 10 minutes dans cet enregistrement (vidéo supplémentaire 2). Chez les mammifères, ainsi que chez la drosophile, une augmentation prononcée de l'histone H4 acétylation marque le début de l'enlèvement de l'histone et le commutateur HP au cours de post-méiotiquespermatogenèse 6,11. Il a été proposé que cette modification épigénétique est une composante essentielle, voire le déclenchement du programme de développement de la HP basculer 10,32. Auparavant, nous avons traité de drosophile testicules de pupes dans la culture avec des inhibiteurs ciblant HAT et HDAC pour influer sur le niveau de l'histone H4 d'acétylation pendant les phases post-méiotiques 12. Dans ces essais pharmacologiques, nous avons trouvé que l'acétylation des histones est essentiel pour la progression de la spermatogenèse étapes de base de la chromatine avec l'histone-étapes de base de la chromatine avec la protamine. Les figures 6 et 7 montrent des résultats représentatifs d'un essai pharmacologique utilisant de l'acide anacardique de cibler HAT dans les testicules des pupes. Testicules à 24 h APF ont été disséqués à partir d'une souche de mouche exprimer H2AvD-DP et ProtamineB-eGFP. Protéine ProtamineB-eGFP était absent dans ces testicules pupes début (figure 6A et B). Après 24 hr dans la culture, les testicules de contrôle a montré des signaux ProtamineB-eGFP, ce qui indique que les premiers kystes étaient apparus au-delà du commutateur HP (figure 6A ', pointes de flèches ouvertes). Ce n'était pas le cas avec les testicules traités avec 150 pM d'acide anacardique (Figure 6B). Testicules préparations de squash et des analyses d'immunofluorescence offrent des informations plus détaillées (figure 7). Dans le témoin non traité, les noyaux des spermatocytes primaires relativement grandes peuvent être reconnus par leur aspect caractéristique des trois régions de l'ADN richement coloré, qui correspondent aux grands chromosomes (niveau 4C) de Drosophila (Figure 7A, colonne 1). L'acétylation de l'histone H4 est clairement détectable à ce stade (figure 7B, colonne 1). La première étape après les divisions de la méiose est connu comme le stade Nebenkern et se caractérise par des rondeurs, des noyaux ronde (voir la figure 4C, non représenté sur la figure 7). L'étape suivante montre la figure 7 est identifié par la croissance flagelle et la forme ronde des noyaux des cellules germinales, qui sont déjà beaucoup plus faible que dans les premiers stades (figure 7A, colonne 2) et montrent très faible à des niveaux presque indétectables de l'histone H4 acétylation (Figure 7B, colonne 2). La forme ronde s'allonge alors (figure 7A, colonne 3), et l'acétylation de l'histone H4 est à nouveau clairement détectable (figure 7B, colonne 3). Les spermatides gagnent alors la scène en forme de canot dans lequel le commutateur HP a lieu et les histones sont remplacés par les protamines (figures 7A – 7 C, colonnes 4 et 5). Après l'étape de canoë, les noyaux protaminated alors allongé plus loin dans une forme d'aiguille très fine dans la maturation des spermatozoïdes (non représenté ici). Préparations testicule de squash de testicules traités avec de l'acide anacardique ont montré différents résultats (figures 7D </ Strong> – 7 F). La chromatine dans les cellules germinales traitées avec de l'acide anacardique est apparu plus condensé que celui des témoins non traités (cf. Figure 7D, on traite et 7A, contrôle). Immunofluorescence Les analyses ont révélé que l'acétylation de H4 est fortement diminuée ou même absente dans les noyaux des cellules germinales traitées avec de l'acide anacardique (Figure 7E). Il est connu que les histones acétylées hautement sont associés à des régions de chromatine ouverte, tandis que les régions qui n'ont pas la chromatine acétylation des histones présentent souvent une structure répressive 33. Par conséquent, il n'est pas surprenant que le traitement avec de l'acide anacardique influencé la structure de la chromatine des noyaux des cellules germinales traitées. Surtout, pas de noyaux de protamine-positif de stade tardif de canoë ou au-delà ont été identifiés dans les testicules traités (figure 7F). Ainsi, nos données sont compatibles avec l'idée que l'activité de la HAT est essentiel pour la spermiogenèse de procéder vientm histone-base de la chromatine à des étapes de la chromatine en fonction de la protamine. Figure 1: Vue d'ensemble de la drosophile spermatogenèse. Le panneau de gauche affiche la séquence des étapes dans le développement des cellules germinales à partir d'une cellule souche de sperme individualisé. Dessins schématiques montrent la morphologie nucléaire caractéristique des cellules germinales. Un spermatogonies se divise pour produire 16 spermatocytes interconnectés dans un kyste. Au cours de cette étape la plupart des transcriptions nécessaires au développement post-méiotique sont produites, en translation réprimée, et stockés. La majeure partie de l'activité transcriptionnelle se termine avec l'entrée dans les divisions de la méiose. Le commutateur histone-à-protamine dans la chromatine a lieu entre le stade de canoë précoce et tardive. Étapes avec une chromatine base histone-sont élevéséclairée en rouge; étapes avec une chromatine base protamine sont surlignés en vert. Les barres dans le panneau de droite indiquent les étapes de cellules germinales qui peuvent normalement être trouvés dans les testicules développement des larves, pupes à environ 24 et 36 heures après la formation du puparium (APF), et les mouches adultes. Figure 2 testicules drosophile à différents stades de développement. (A) de l'image en contraste de phase de l'ensemble du montage d'un testicule légèrement écrasé d'une larve de troisième stade (L3). Seuls les stades pré-méiotiques et méiotiques peuvent être trouvés. Les spermatogonies sont limités à la pointe antérieure sous la zone du moyeu (astérisque). Le testicule restant est rempli de spermatocytes (flèche ouverte). (B) de l'image en contraste de phase d'un testicule légèrement écrasé à environ 24 heures après la formation du puparium (APF). En plus de spermatocytes (flèche ouverte), le testicule contient spermatides au stade Nebenkern (têtes de flèches ouvertes), avec des noyaux ronds et spermatides en élongation étapes avec flagelles croissance (double flèche ouverte) (C – E). L'ensemble du montage testicules pupes exprimer H2AvD-DP et ProtamineB-eGFP (superpositions de contraste de phase et eGFP et images de fluorescence de la DP). (C) du testicule chrysalide disséqués à environ 24 h APF. Arrowhead marque auto-fluorescence des putatifs cellules du corps de graisse. D) chrysalide testicules disséqués à environ 36 h APF affiche la première kyste ProtamineB-eGFP-positif (flèche). (E) la nymphe testicule à environ 48 h APF avec un groupe de kystes ProtamineB-eGFP-positifs (flèches). Dans toutes les parties de figure, les astérisques indiquent la région de moyeu. Les barres d'échelle: 100 um.ank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3 Imagerie en temps réel de l'interrupteur histone-à-protamine dans un testicule des pupes de plus en plus ex vivo. (A) de l'image en contraste de phase d'un testicule pupe exprimer H2AvD-DP et ProtamineB-eGFP pris en culture à environ 45 h après la formation du puparium (APF). La vésicule séminale est indiqué par une flèche remplie. Un paragonium (double-flèche) reste attaché au testicule. (A ') et eGFP DP fluorescence du testicule représenté en (A). La flèche indique ouvert un kyste ProtamineB-eGFP-positif. Barre d'échelle:. 100 um (B) Après 2 h 30 min dans la culture, plusieurs autres kystes (flèche ouverte) émerger from la transition histone-à-protamine. (C) Après une ca. supplémentaires 3 h dans la culture, soit un total de 5 h 29 min dans la culture, un groupe de kystes (flèche ouverte) avec un signal fort ProtamineB-eGFP est visible à l'extrémité proximale du testicule. Voir aussi la vidéo supplémentaire 1. Dans toutes les parties de figure, les astérisques indiquent la zone du moyeu. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 4. kystes isolés de cellules germinales à différents stades de développement. (A) Les kystes disséqués à partir d'un testicule à environ 24 heures après la formation du puparium (APF). Superposition de contraste de phase et H2AvD-DP fluorescence (rouge) des images. Barre d'échelle: 100 um.Les grossissements de kystes simples de différentes étapes – (E B). Superposition de contraste d'interférence différentiel (DIC) et des images de fluorescence H2AvD-DP. Barre d'échelle:. 20 pm (B) à kyste de 16 spermatocytes (C) kyste de 64 spermatides rondes au stade Nebenkern.. La structure Nebenkern développe à partir de mitochondries fusionnées et est visible dans les images DIC à côté du noyau (tête de flèche ouverte). (D) kyste de spermatides à noyaux ronde H2AvD-DP-positif et flagelles élongation (flèche vide indique une structure Nebenkern élongation qui accompagne le axonème croissance). (E) de la pointe d'un kyste apical des spermatides au stade de canoë début montrant une forme allongée nucléaire. Les flagelles largement allongée ne sont que partiellement visible. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 5 images en direct d'un seul kyste de 16 spermatocytes méiose I ex vivo. Des images de fluorescence d'une kyste dans la culture exprimant H2AvD-DP. Représentés sont des étapes caractéristiques de la méiose I. spermatocytes dans le kyste passer par les divisions de la méiose d'une manière comme une vague. (A) La condensation des chromosomes commence dans les noyaux d'un côté du kyste (2) et progresse dans le kyste (direction indiquée par la flèche ). Noyaux dans la région opposée (1) représente un stade plus précoce de la condensation de la chromatine, où des régions d'histone-dense marquant les trois grands chromosomes peuvent encore être discernés. Spermatocytes dans la région (2) contiennent des chromosomes parfaitement résumés, visible sous forme de taches fluorescentes vives. (B) Après le 300; min, les premiers spermatocytes dans la région (2) sont en télophase (têtes de flèches ouvertes), tandis que la condensation des chromosomes continue dans la région (1) (C) Dans les dernières spermatocytes de la région (1), les chromosomes (pointes de flèche) sont disposés. à la métaphase plaque 20 min plus tard. (D) Dans un autre 15 minutes, les dernières spermatocytes semblent avoir achevé la télophase et sont maintenant prêts à subir la cytokinèse (flèches ouvertes). Voir aussi complémentaire vidéo 2 Barre d'échelle:.. 50 pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 6 acide anacardique inhibe l'interrupteur histone-à-protamine dans les testicules des pupes de culture. Testicules pupes expressi ng H2AvD-DP et ProtamineB-eGFP et disséqués à 24 h après la formation du puparium (APF) ont été incubées pendant 24 heures dans un milieu sans inhibiteur (contrôle, A, A '; DMSO, diméthylsulfoxyde) ou dans un milieu supplémenté avec 150 uM acide anacardique ( B, B '). régions Hub indiquées par des astérisques. (A, B) Pas de kystes ProtamineB-eGFP positives peuvent être observées après dissection. (A ') Après 24 heures d'incubation, certains kystes ont subi l'histone-à-protamine interrupteur et ProtamineB-eGFP-positif kystes (têtes de flèche vides) peuvent être observés. (B ') des testicules traités avec de l'acide anacardique ne développent pas de kystes ProtamineB-eGFP-positifs. Barre d'échelle:. 100 um S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 68 / 51868fig7highres.jpg "width =" 500 "/> Figure 7 acide anacardique affecte l'histone H4 acétylation et la structure de la chromatine des spermatides préparations de squash de noyaux spermatides de testicules de nymphose (24 h APF) exprimant ProtamineB-eGFP incubé pendant 24 heures sans inhibiteur (A – C). Ou 150 uM acide anacardique (D – F). ADN coloré avec le colorant Hoechst (A et D). Acétylation H4 analysée par immunofluorescence (B et E). Présence de protamines surveillées avec le signal ProtamineB-eGFP (C et F). Après traitement avec de l'acide anacardique, la chromatine apparaît fortement compacté (D) et le signal d'acétylation H4 est complètement réduite dans toutes les étapes (E) spermatides. En outre, l'acide anacardique-traitéetesticules ne présentent pas de kystes de l'étape de canoë fin ou au-delà et aucun signal ProtamineB-eGFP (F). Barre d'échelle: 10. Pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Supplémentaire Vidéo 1. imagerie en direct via eGFP et DP fluorescence de l'interrupteur histone-à-protamine dans un testicule pupe ex vivo. Vidéo de 6 h imagerie en fonction du temps de plus en plus illustre la transition histone-à-protamine par l'augmentation de la prévalence de ProtamineB- kystes eGFP-positifs. Les images ont été acquises toutes les 5 min. Pour plus de détails, voir la figure 3. (Voir "suppl_video_1.MOV" sous Downloads). Supplémentaire Vidéo 2 Imagerie en temps réel d'un seul kyste méiose 16 spermatocytes I ex vivo. Time-lapse fluorescent imagerie d'unkyste dans la culture exprimant H2AvD-DP au cours de 80 min. Cette vidéo montre les étapes caractéristiques de la méiose I. Les images ont été acquises chaque 1 min. Pour plus de détails, voir la Figure 5. (Voir "suppl_video_2.MOV" sous Downloads).