Isolatie van Murine Valve endotheelcellen
Summary
The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.
Abstract
Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.
Introduction
De rijpe klep bestaat uit drie gelaagde lagen gespecialiseerde extracellulaire matrix (ECM) afgewisseld met ventiel interstitiële cellen (VIC) en ingekapseld door een enkele laag hartklep endotheelcellen (VECs) 1. De rol van de ECM is alle noodzakelijke biomechanische eigenschappen te verschaffen op de voortdurend veranderende hemodynamische werking weerstaan tijdens de hartcyclus. Omzet van de klep ECM in de volwassen klep wordt strak gereguleerd door VIC die grotendeels rustige en fibroblast-achtige in afwezigheid van ziekte. Naast de VIC bevolking, hartklep endotheelcellen (VECs) vormen een ononderbroken endotheel over het oppervlak van de klepslippen 2. Terwijl het belang van de ECM en de VIC's voor klep structuur en functie zijn beschreven door ons en anderen, wordt de rol van VECs minder bekend. Echter, deze relatief kleine celpopulatie is essentieel voor de vorming klep in het embryo en wordt beschreven als disfunctioneel ventielziekte.
Hartvorming klep in het embryo begint als een subset van endotheelcellen in de atrioventriculaire kanaal en uitstroombaan regio ondergaan endotheliale naar mesenchymale transformatie (EMT) en vorm zwellingen bekend als endocardiale kussens 1,3. De nieuw getransformeerde mesenchymale cellen binnen deze structuren later differentiëren in VIC en vormen de volwassen kleppen. Zodra EMT is voltooid, endotheliale cellen rondom de kussens, VECs genoemd, vormen een ononderbroken endotheliale cellaag die de mature klep tegen schade beschermt. Bovendien VECs zin de hemodynamische omgeving en is aangetoond dat moleculair communiceren met onderliggende VIC regulering ECM homeostase 1,3. In zieke kleppen, is het VEC monolaag verstoord in samenwerking met abnormale veranderingen in de ECM-organisatie en veranderde biomechanica 4,5. Bovendien studies in muismodellen suggereren dat VEC disfunctie de onderliggende oorzaak van klep disease 1,6-9. Als VECs spelen een belangrijke rol bij klep ontwikkeling, onderhoud en ziekte, is het van belang dat we de temporele fenotypen volledig te bepalen om het veld bevorderen en mechanismen van ziekten begrijpen.
Eerder werk van verschillende laboratoria met succes geïsoleerd VECs van varkens en schapen modellen 10-12. Vanwege de grote omvang van deze kleppen, isolatie door zwabberen en / of enzymatische digestie, gevolgd door een aantal verschillende isolatiemethoden waaronder magnetische korrel scheiding cel en cel klonale expansie effectief pure populaties 11-13 genereren geweest. Echter, deze modellen beperkend vanwege de onvolledige annotatie van de varkens en schapen genomen een beperking van de moleculaire instrumenten naast de hoge kosten. Daarom experimenteren van varkens en schapen VECs na isolatie kan beperkend zijn. Muismodellen zijn voorkeur vanwege de vele mogelijkheden voor genetische manipulatie en moleculaire technieken in het embryo en volwassen, maar tot op heden geen VEC isolatie in kleine proefdiermodellen zijn gemeld. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de moeilijkheid van het werken met kleine weefselmonsters minderheid celpopulatie die nog ontbreken unieke identiteit van VEC-specifieke markers, waardoor antilichamen gebaseerde isolatiemethoden voorkomen omvatten.
In dit artikel beschrijven we een nieuwe methode voor directe isolatie van muizen VECs op embryonale en volwassen stadia. Dit protocol maakt gebruik van Tie2-GFP muizen die GFP in alle endotheliale celtypes tot expressie en zijn uitgebreid gebruikt om endotheelcellen populaties 14 bestuderen. De nieuwheid van deze studie is dat deze muizen voor de eerste keer zijn gebruikt om endotheelcellen te isoleren van de kleppen. Door zorgvuldige dissectie van het klepweefsel en een reeks van negen enzymatische digestie gevolgd door FACS-sortering kan VECs worden geïsoleerd en gebruikt voor diverse experimentele techniekenclusief RNA-extractie en cultuur, direct na het sorteren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we voor de eerste keer een nieuwe methode voor het isoleren van embryonale en volwassen muizen VECs van Tie2-GFP muizen. Hoewel deze muis lijn uitgebreid is gebruikt voor het isoleren van endotheliale celpopulaties, is dit het eerste rapport met selectieve isolatie van VECs. Vanwege de kwetsbaarheid van de VEC populatie hebben we een stringent protocol waarmee voor enkele cel isolatie van GFP positieve (en GFP negatief) cellen van hartkleppen van embryonale en volwassen muizen ontwikkelden. Vergeleken met de oorspronkelijke publicatie met gehele embryo of organen van Tie2-GFP muizen 14 hebben we collagenase en dissectie stappen achtereenvolgens op de lage abundantie van deze kwetsbare endotheliale celpopulatie een select populatie van cellen te isoleren geoptimaliseerd.
VEC isolaties hebben voorheen alleen gemeld in grote diermodellen met een beperkte genetische en biomoleculaire gereedschappen. Deze tools zijn goed ingeburgerd in muizen en daarom de ability murine VECs isoleren maakt een uitgebreide reeks experimentele ontwerpen worden gebruikt voor hartklep onderzoek. Daarom is een belangrijk voordeel van deze benadering is dat VECs tijdelijk kunnen worden geïsoleerd uit wild type muizen en modellen van de klep ziekten en letsel. Een tweede voordeel is dat VECs kan worden geïsoleerd en vrijwel direct na dissectie geanalyseerd behoud expressiepatronen die de in vivo situatie beter reflecteren. Verder, deze isolatieprotocol volstaat celcultuur elimineren voor nummer expansie en dus potentiële fenotypische veranderingen bij de in vitro omgeving worden voorkomen.
Ondanks de nieuwigheden en experimentele voordelen van dit protocol, erkennen wij dat de beperkingen nog steeds bestaan. Ten eerste de grootte van de VEC bevolking in muizen kleppen is zeer klein en daarom worden meerdere getimede embryonale nesten noodzakelijk om voldoende RNA genexpressie analyse genereren. Terwijl this kan worden overwonnen met behulp van meerdere fokkers, kan het een impact hebben op de toepassing van een aantal na-isolatie analysetools hebben. Deze beperking is een uitdaging bijzonder voor vaststelling confluente kweken van GFP-positieve VECs om grondiger analyses van VEC fenotypen zoals moleculaire profielen en functionele assays. Daarom erkennen wij dat niet alle problemen zijn opgelost door onze aanpak, maar dit is een gebied van belang dat we streven om te overwinnen.
Deze benadering van het isoleren VECs van valvulaire regio introduceert de mogelijkheid van contaminatie van de Tie-GFP -positieve, niet-valvulaire endotheelcellen van het endocard, of vasculaire structuren binnen het ventriculaire myocard. Tot op heden hebben de moleculaire onderscheid van VECs van andere cardiale endotheelcellen populatie niet geïdentificeerd. Echter een enhancer regio van het Nfatc1 gen is geïdentificeerd en aangetoond dat specifiek label VECs dat niet doenEMT ondergaan en geen andere endotheliale celpopulatie in het hart 18. Als Cre model (Nfatc1 Encre) beschikbaar is, kan de toekomstige studies de specificiteit van deze lijn te gebruiken om besmetting risico's te minimaliseren. Naast niet-valvulaire Tie2-GFP-positieve cellen, is er altijd de mogelijkheid van besmetting van myocyten op het punt waar de klepbladen hechten aan het ringvormige gebied van het septum mural myocardiale wanden. In data niet getoonde wij aanvankelijk begonnen studies isoleren VECs van ontleed valvulaire regio met behulp van antilichaam-geconjugeerde kralen gecoat met anti-GFP en anti-CD31. Hoewel deze benadering succesvol voor het isoleren van de endotheelcellen was, ondervonden we aanzienlijke cel klonteren van aangrenzende, niet-endotheliale celsoorten en derhalve VIC en myocardiale cellen besmet onze experimentele monster. Deze is vermeden middels FACS analyse parameters zijn ingesteld om slechts enkele celsuspensie isolerens en PCR analyse detecteren expressie van myocyten specifieke genen gecontroleerd voor deze beperking (figuur 3). Terwijl onze vervuiling kan worden beschouwd als minimaal, het blijft een potentiële experimentele complexiteit die kan worden vermeden in de toekomst met de dubbele selectie van GFP en endotheelcellen-specifieke oppervlakte markers.
Met dit protocol, hebben we met succes geïsoleerd VECs van embryonale en volwassen muizen en voorbeelden gegeven van hoe deze aanpak kan worden gebruikt voor RNA-isolatie en celkweek van GFP positieve en negatieve GFP celpopulaties. Echter, deze benadering niet beperkt tot deze toepassingen en kan worden gebruikt voor een grote verscheidenheid aan moleculaire, cellulaire en functionele benaderingen. Daarnaast kan de Tie2-GFP achtergrond worden gefokt met genetische muismodellen die zal zorgen voor vergelijkende studies van VEC bevolking in gezondheid en ziekte. De ontwikkeling van deze nieuwe methodologie voor het eerst kunnen worden gericht studiesonderzoekt de bijdrage van VECs in ontwikkeling en onderhoud klep en eerder unappreciated mechanismen van endotheel-afhankelijke klep ziekte kunnen onthullen.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de Ohio State University Comprehensive Cancer Center Analytische Cytometry Core faciliteit, specifiek Katrina Moore, voor technische bijstand met FACS-analyse. Daarnaast herkennen we Dr William Pu en zijn groep voor hun wetenschappelijke inzichten. Dit werk werd ondersteund door NIH HL091878 (JL) en The Heart Center in Nationwide Children's Hospital.
Materials
| [header] | |||
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life Technologies | A-11077 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| 2.5% Trypsin | Invitrogen LT | 15090-046 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553370 | |
| Chick Serum | Invitrogen LT | 16110-082 | |
| Collagenase IV | Invitrogen LT | 17104-019 | Prepared according to manufactuer's instructions |
| DNase I, RNase free (10,000 Units) | Roche | 4716728001 | |
| EBM-2 | Lonza | CC3156 | For VEC media |
| EDTA, 0.5M Solution | Hoefer | 03-500-506 | |
| EGM2 SingleQuot, Bulletkit | Lonza | CC-4176 | For VEC media |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Hyclone | SH3007103IH | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025-092 | |
| Horse Serum | Invitrogen LT | 16050-130 | |
| Hybridization Oven | VWR | 230301V | |
| Medium 199 1X | Corning Cell gro | 10-060-CV | |
| Paraformaldehyde 16% Solution EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pen/Strep | MP-Biomed | ICN1670049 | |
| Permanox sterile chamber slide with cover | Thermo-Scientific | 177429 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning Cell gro | 21-040-CV | |
| PrimeTime Mini qPCR Assay | Integrated DNA Technologies | Acta2 (αSMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| SuperScript VILO Mastermix | Invitrogen LT | 11755050 | |
| Tie2-GFP mice | Jackson Laboratories | 3658 | |
| Tissue forceps #5 11cm | Dumont | 14096 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| α-SMA anti-mouse antibody | Sigma-Aldrich | A2547 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |
References
- Tao, G., Kotick, J. D., Lincoln, J. Heart valve development, maintenance, and disease: the role of endothelial cells. Current topics in developmental biology. 100, 203-232 (2012).
- Lincoln, J., Yutzey, K. E. Molecular and developmental mechanisms of congenital heart valve disease. Birth defects research. Part A, Clinical and molecular teratology. 91, 526-534 (2011).
- Tao, G., Levay, A. K., Gridley, T., Lincoln, J. Mmp15 is a direct target of Snai1 during endothelial to mesenchymal transformation and endocardial cushion development. Developmental biology. 359, 209-221 (2011).
- Weinberg, E. J., Mack, P. J., Schoen, F. J., Garcia-Cardena, G., Kaazempur Mofrad, M. R. Hemodynamic environments from opposing sides of human aortic valve leaflets evoke distinct endothelial phenotypes in vitro. Cardiovasc Eng. 10, 5-11 (2010).
- Hinton, R. B. Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves. Circulation research. 98, 1431-1438 (2006).
- Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. Hemodynamic and cellular response feedback in calcific aortic valve disease. Circulation research. 113, 186-197 (2013).
- Bosse, K., et al. Endothelial nitric oxide signaling regulates Notch1 in aortic valve disease. Journal of molecular and cellular cardiology. 60, 27-35 (2013).
- Laforest, B., Andelfinger, G., Nemer, M. Loss of Gata5 in mice leads to bicuspid aortic valve. The Journal of clinical investigation. 121, 2876-2887 (2011).
- Hofmann, J. J., et al. Endothelial deletion of murine Jag1 leads to valve calcification and congenital heart defects associated with Alagille syndrome. Development. 139, 4449-4460 (2012).
- Wylie-Sears, J., Aikawa, E., Levine, R. A., Yang, J. H., Bischoff, J. Mitral valve endothelial cells with osteogenic differentiation potential. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 31, 598-607 (2011).
- Gould, R. A., Butcher, J. T. Isolation of valvular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2010).
- Butcher, J. T., Penrod, A. M., Garcia, A. J., Nerem, R. M. Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 24, 1429-1434 (2004).
- Cheung, W. Y., Young, E. W., Simmons, C. A. Techniques for isolating and purifying porcine aortic valve endothelial cells. The Journal of heart valve disease. 17, 674-681 (2008).
- Motoike, T., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28, 75-81 (2000).
- Peacock, J. D., Lu, Y., Koch, M., Kadler, K. E., Lincoln, J. Temporal and spatial expression of collagens during murine atrioventricular heart valve development and maintenance. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 3051-3058 (2008).
- Levay, A. K., et al. Scleraxis is required for cell lineage differentiation and extracellular matrix remodeling during murine heart valve formation in vivo. Circulation research. 103, 948-956 (2008).
- Lincoln, J., Alfieri, C. M., Yutzey, K. E. BMP and FGF regulatory pathways control cell lineage diversification of heart valve precursor cells. Developmental biology. 292, 292-302 (2006).
- Wu, B., et al. Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation. Circulation research. 109, 183-192 (2011).
