عزل خلايا الفئران صمام غشائي
Summary
The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.
Abstract
Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.
Introduction
ويتكون صمام ناضجة من ثلاث طبقات طبقية من المصفوفة خارج الخلية المتخصصة (ECM) تتخللها خلايا الخلالية صمام (فيكس) ومغلفة بطبقة واحدة من الخلايا البطانية صمام القلب (VECs) 1. دور ECM هو توفير جميع خصائص النشاط الحيوي اللازمة لتحمل التغيرات المستمرة في قوة الدورة الدموية أثناء دورة القلب. وينظم دوران ECM صمام في صمام الكبار بإحكام بواسطة فيكس التي هي هادئة إلى حد كبير ومثل الخلايا الليفية، في غياب المرض. بالإضافة إلى السكان VIC، والخلايا البطانية صمام القلب (VECs) تشكل البطانة دون انقطاع على سطح الشرفات صمام 2. في حين وصفت أهمية ECM وفيكس للهيكل صمام وظيفة من قبلنا وغيرها، ودور VECs أقل شهرة. ومع ذلك، هذه الفئة من السكان خلية صغيرة نسبيا هو أمر حاسم لتشكيل صمام في الجنين، ويتم وصفها بأنها مختلة في صمامالمرض.
تشكيل صمام القلب في الجنين يبدأ عند مجموعة فرعية من الخلايا البطانية داخل المناطق القناة وتدفق القناة الأذينية البطينية تخضع البطانية إلى التحول الوسيطة (EMT) وشكل تورمات المعروفة باسم سائد شغافية 1،3. خلايا اللحمة المتوسطة تحولت حديثا ضمن هذه الهياكل تفرق في وقت لاحق إلى فيكس وتشكل صمامات ناضجة. مرة واحدة اكتمال EMT، والخلايا البطانية التي تحيط الوسائد، ويطلق VECs، تشكل طبقة الخلايا البطانية دون انقطاع يحمي صمام ناضجة ضد الاصابة. بالإضافة إلى ذلك، VECs بمعنى البيئة والدورة الدموية وقد ثبت أن جزيئيا التواصل مع فيكس الأساسي لتنظيم ECM التوازن 1،3. في الصمامات المريضة، تعطل أحادي الطبقة مركزنا بالتعاون مع تغيرات غير طبيعية في المؤسسة ECM والميكانيكا الحيوية غيرت 4،5. بالإضافة إلى ذلك، تشير الدراسات في نماذج الماوس التي خلل مركزنا هو السبب الكامن وراء صمام دisease 1،6-9. كما VECs تلعب دورا هاما في تطوير صمام، والصيانة، والمرض، فمن المهم أن نحدد تماما من الظواهر الزمنية من أجل المضي قدما الميدان وفهم آليات المرض.
العمل السابق عدة مختبرات قد عزل بنجاح VECs من الخنازير والأغنام نماذج 10-12. نظرا لحجم كبير من هذه الصمامات، والعزلة من خلال ينظف و / أو الهضم الأنزيمي، تليها عدد من الأساليب المختلفة بما في ذلك العزلة المغناطيسي فصل خلية حبة وحيدة الخلية التوسع النسيلي كانت فعالة لتوليد السكان النقي 11-13. ومع ذلك، يمكن لهذه النماذج أن يكون مقيدا بسبب الشرح غير مكتمل من الخنازير والأغنام الجينوم الحد من توافر الأدوات الجزيئية بالإضافة إلى ارتفاع التكاليف. لذا التجريب من الخنازير والأغنام VECs بعد العزلة يمكن أن يكون تقييدا. نماذج الماوس هي المفضلة بسبب عدة احتمالات للmanipula الوراثيةنشوئها والأدوات الجزيئية في الجنين والكبار، ولكن حتى الآن، لم ترد تقارير عن العزلة مركزنا في النماذج الحيوانية الصغيرة. هذا هو الأرجح بسبب صعوبة العمل مع عينات الأنسجة الصغيرة التي تضم أقلية السكان الخلية التي تفتقر حاليا هوية فريدة من علامات مركزنا محددة، وبالتالي منع أساليب العزلة القائمة على الأجسام المضادة.
في هذه المقالة، ونحن التقرير طريقة جديدة لعزل مباشرة من VECs الفئران في المراحل الجنينية والكبار. هذا البروتوكول يستفيد من الفئران Tie2-GFP، التي تعبر عن GFP في جميع أنواع الخلايا البطانية والتي استخدمت على نطاق واسع لدراسة السكان الخلية البطانية 14. ومع ذلك، فإن حداثة هذه الدراسة الحالية هي أن هذه الفئران، للمرة الأولى استخدمت لعزل الخلايا البطانية من الصمامات. عن طريق تشريح دقيق للأنسجة صمام وسلسلة من تسعة الهضم الأنزيمية تليها FACS الفرز، VECs يمكن عزلها واستخدامها لأساليب فنية تجريبية مختلفة فيبغرض اختتامها استخراج الحمض النووي الريبي والثقافة، مباشرة بعد الفرز.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن هنا وصف لأول مرة، وهي طريقة جديدة لعزل VECs الفئران الجنينية والكبار من الفئران Tie2-GFP. في حين أن هذا الخط الماوس استخدمت على نطاق واسع لعزل السكان الخلية البطانية، وهذا هو التقرير الأول يبين العزلة انتقائية من VECs. بسبب هشاشة من السكان مركزنا، وقد وضعنا بروتوكول صرامة التي تسمح لعزل خلية واحدة من GFP إيجابي (وGFP السلبية) صمامات القلب من خلايا الفئران الجنينية والكبار. مقارنة المنشور الأصلي باستخدام الأجنة أو الأعضاء كاملة من الفئران GFP Tie2-14، قمنا الأمثل كولاجيناز وتشريح الخطوات على أساس وفرة منخفضة من هذه الفئة من السكان الخلايا البطانية الهش لعزل السكان حدد من الخلايا.
سبق فقط تم الإبلاغ عن العزلة مركزنا في نماذج حيوانية كبيرة مع الأدوات الوراثية والجزيئية البيولوجية محدودة. يتم وضع هذه الأدوات جيدا في الفئران وبالتالي فإن أبيعنه lity لعزل VECs الفئران يسمح لمجموعة موسعة من التصاميم التجريبية لاستخدامها في البحوث صمام القلب. ولذلك، ميزة كبيرة لهذا النهج هو أن VECs يمكن عزل زمنيا من نوع الفئران البرية، ونماذج من الأمراض والإصابات صمام. والميزة الثانية هي أن VECs يمكن عزل وتحليلها على الفور تقريبا بعد تشريح، والحفاظ على أنماط التعبير التي تعكس الوضع في الجسم الحي بشكل أكثر دقة. علاوة على ذلك، هذا البروتوكول العزلة كافية للقضاء على زراعة الخلايا للتوسع عدد والتغيرات المظهرية بالتالي المحتملة الناجمة عن البيئة في المختبر يتم منعها.
على الرغم من المستجدات والفوائد التجريبية من هذا البروتوكول، ونحن ندرك أن القيود لا تزال موجودة. أولا، وحجم السكان مركزنا ضمن صمامات الفئران صغيرة جدا، وبالتالي، هناك حاجة إلى عدة الفضلات الجنينية في الوقت المناسب من أجل توليد RNA كافية لتحليل التعبير الجيني. بينما ثيق يمكن التغلب عليها باستخدام مربي متعددة، يمكن أن يكون لها تأثير على تطبيق بعض أدوات التحليل بعد العزلة. وكان هذا القيد تحديا بشكل خاص لتكوين الثقافات متموجة من VECs GFP إيجابية من أجل إجراء المزيد من التحليلات وافية من الظواهر مركزنا بما في ذلك التشكيلات الجزيئية والمقايسات الفنية. ولنعترف أن ليس كل الصعوبات التي تم التغلب على نهجنا ولكن هذا هو مجال اهتمام أننا نسعى إلى التغلب عليها.
هذا النهج من عزل VECs من مناطق صمامي يقدم إمكانية حدوث تلوث من التعادل GFP خلايا -positive، غير صمامي البطانية من البطانة، أو هياكل الأوعية الدموية داخل عضلة القلب البطيني. حتى الآن، لم يتم التعرف التمييز الجزيئي للVECs من غيرهم من السكان الخلايا البطانية القلب. لكن منطقة محسن من الجين Nfatc1 تم التعرف وأظهرت لتسمية تحديدا VECs التي لاالخضوع EMT، وليس السكان الخلية البطانية الآخرين داخل القلب 18. كنموذج لجنة المساواة العرقية (Nfatc1 enCre) هو متاح، يمكن أن الدراسات المستقبلية الاستفادة من خصوصية هذا الخط لتقليل مخاطر التلوث. بالإضافة إلى خلايا إيجابية Tie2-GFP- غير صمامي، هناك دائما إمكانية حدوث تلوث من myocytes عند النقطة التي نعلق منشورات صمام إلى المنطقة الحلقي من الحاجز والجدران عضلة القلب الجدارية. في البيانات لا تظهر هنا، بدأنا في البداية دراسات لعزل VECs من مناطق صمامي تشريح باستخدام الخرز الأجسام المضادة مترافق مع المغلفة مكافحة GFP ومكافحة CD31. بينما كان هذا النهج الناجح لعزل الخلايا البطانية، عانينا من تكتل كبير من الخلايا المجاورة أنواع الخلايا، غير البطانية وبالتالي فيكس وخلايا عضلة القلب ملوثة العينة التجريبية لدينا. تم تجنب ذلك باستخدام تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية حيث تم تعيين المعلمات لعزل الوحيد تعليق خلية واحدةق وتحليل PCR للكشف تمت السيطرة التعبير عن الجينات العضلية محددة لهذا القيد (الشكل 3). بينما تلوث دينا يمكن اعتبار الحد الأدنى و، يبقى التعقيد التجريبي المحتملة التي يمكن تجنبها في المستقبل مع اختيار مزدوجة من GFP وعلامات سطح الخلية البطانية محددة.
باستخدام هذا البروتوكول، لدينا VECs معزولة بنجاح من الفئران الجنينية والكبار وقدمت أمثلة للكيفية التي يمكن أن تستخدم هذا الأسلوب لعزل الحمض النووي الريبي والثقافة خلية GFP السكان الخلية الإيجابية والسلبية GFP. ومع ذلك، فإن هذا النهج لا يقتصر على هذه التطبيقات، ويمكن استخدامها لمجموعة كبيرة من الأساليب الجزيئية، الخلوية والوظيفية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكون ولدت الخلفية Tie2-GFP مع نماذج الماوس الوراثية من شأنها أن تسمح للدراسات المقارنة للسكان VEC في الصحة والمرض. فإن تطوير هذه المنهجية الجديدة، لأول مرة، والسماح للدراسات مركزةدراسة مساهمة VECs في تطوير صمام وصيانة، ويمكن أن تكشف عن آليات تأخذ حقها من التقييم سابقا من مرض صمام تعتمد على البطانية.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر مرفق جامعة ولاية أوهايو مركز السرطان الشامل تحليلية الخلوي الأساسية، وتحديدا كاترينا مور، للمساعدة التقنية مع تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية. وبالإضافة إلى ذلك فإننا ندرك الدكتور ويليام بو وجماعته للرؤى العلمية. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة HL091878 (JL) ومركز القلب في مستشفى الأطفال على الصعيد الوطني.
Materials
| [header] | |||
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life Technologies | A-11077 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| 2.5% Trypsin | Invitrogen LT | 15090-046 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553370 | |
| Chick Serum | Invitrogen LT | 16110-082 | |
| Collagenase IV | Invitrogen LT | 17104-019 | Prepared according to manufactuer's instructions |
| DNase I, RNase free (10,000 Units) | Roche | 4716728001 | |
| EBM-2 | Lonza | CC3156 | For VEC media |
| EDTA, 0.5M Solution | Hoefer | 03-500-506 | |
| EGM2 SingleQuot, Bulletkit | Lonza | CC-4176 | For VEC media |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Hyclone | SH3007103IH | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025-092 | |
| Horse Serum | Invitrogen LT | 16050-130 | |
| Hybridization Oven | VWR | 230301V | |
| Medium 199 1X | Corning Cell gro | 10-060-CV | |
| Paraformaldehyde 16% Solution EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pen/Strep | MP-Biomed | ICN1670049 | |
| Permanox sterile chamber slide with cover | Thermo-Scientific | 177429 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning Cell gro | 21-040-CV | |
| PrimeTime Mini qPCR Assay | Integrated DNA Technologies | Acta2 (αSMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| SuperScript VILO Mastermix | Invitrogen LT | 11755050 | |
| Tie2-GFP mice | Jackson Laboratories | 3658 | |
| Tissue forceps #5 11cm | Dumont | 14096 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| α-SMA anti-mouse antibody | Sigma-Aldrich | A2547 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |
References
- Tao, G., Kotick, J. D., Lincoln, J. Heart valve development, maintenance, and disease: the role of endothelial cells. Current topics in developmental biology. 100, 203-232 (2012).
- Lincoln, J., Yutzey, K. E. Molecular and developmental mechanisms of congenital heart valve disease. Birth defects research. Part A, Clinical and molecular teratology. 91, 526-534 (2011).
- Tao, G., Levay, A. K., Gridley, T., Lincoln, J. Mmp15 is a direct target of Snai1 during endothelial to mesenchymal transformation and endocardial cushion development. Developmental biology. 359, 209-221 (2011).
- Weinberg, E. J., Mack, P. J., Schoen, F. J., Garcia-Cardena, G., Kaazempur Mofrad, M. R. Hemodynamic environments from opposing sides of human aortic valve leaflets evoke distinct endothelial phenotypes in vitro. Cardiovasc Eng. 10, 5-11 (2010).
- Hinton, R. B. Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves. Circulation research. 98, 1431-1438 (2006).
- Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. Hemodynamic and cellular response feedback in calcific aortic valve disease. Circulation research. 113, 186-197 (2013).
- Bosse, K., et al. Endothelial nitric oxide signaling regulates Notch1 in aortic valve disease. Journal of molecular and cellular cardiology. 60, 27-35 (2013).
- Laforest, B., Andelfinger, G., Nemer, M. Loss of Gata5 in mice leads to bicuspid aortic valve. The Journal of clinical investigation. 121, 2876-2887 (2011).
- Hofmann, J. J., et al. Endothelial deletion of murine Jag1 leads to valve calcification and congenital heart defects associated with Alagille syndrome. Development. 139, 4449-4460 (2012).
- Wylie-Sears, J., Aikawa, E., Levine, R. A., Yang, J. H., Bischoff, J. Mitral valve endothelial cells with osteogenic differentiation potential. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 31, 598-607 (2011).
- Gould, R. A., Butcher, J. T. Isolation of valvular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2010).
- Butcher, J. T., Penrod, A. M., Garcia, A. J., Nerem, R. M. Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 24, 1429-1434 (2004).
- Cheung, W. Y., Young, E. W., Simmons, C. A. Techniques for isolating and purifying porcine aortic valve endothelial cells. The Journal of heart valve disease. 17, 674-681 (2008).
- Motoike, T., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28, 75-81 (2000).
- Peacock, J. D., Lu, Y., Koch, M., Kadler, K. E., Lincoln, J. Temporal and spatial expression of collagens during murine atrioventricular heart valve development and maintenance. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 3051-3058 (2008).
- Levay, A. K., et al. Scleraxis is required for cell lineage differentiation and extracellular matrix remodeling during murine heart valve formation in vivo. Circulation research. 103, 948-956 (2008).
- Lincoln, J., Alfieri, C. M., Yutzey, K. E. BMP and FGF regulatory pathways control cell lineage diversification of heart valve precursor cells. Developmental biology. 292, 292-302 (2006).
- Wu, B., et al. Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation. Circulation research. 109, 183-192 (2011).
