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Bio-ingénierie

심방과 심실에서 심장 근육 세포에 관형 막 네트워크 분석

Published: October 15, 2014
doi:
10.3791/51823
, , ,
1Heart Research Center Goettingen, 2Clinic of Cardiology & Pulmonology,University Medical Center Goettingen, 3German Center for Cardiovascular Research (DZHK) partner site Goettingen, 4BioMET, Center for Biomedical Engineering & Technology,University of Maryland School of Medicine

Summary

심장 근육 세포에서 관형 막 구조가 세포 내 네트워크를 형성한다. 우리는 품질 관리, 최첨단 형광 현미경 II) 살아있는 세포 염색을 포함하여 마우스의 심장에서 심근 세포의 난) 절연을위한 프로토콜을 최적화 대해 설명하고, ⅲ) 직접 이미지 분석은 구성 요소의 복잡성과 세포 멤브레인의 가소성을 정량화하기 네트워크.

Abstract

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules – the transverse-axial tubule system (TATS) – controls deep intracellular signaling functions. While the outer surface membrane and associated TATS membrane components appear to be continuous, there are substantial differences in lipid and protein content. In ventricular myocytes (VMs), certain TATS components are highly abundant contributing to rectilinear tubule networks and regular branching 3D architectures. It is thought that peripheral TATS components propagate action potentials from the cell surface to thousands of remote intracellular sarcoendoplasmic reticulum (SER) membrane contact domains, thereby activating intracellular Ca2+ release units (CRUs). In contrast to VMs, the organization and functional role of TATS membranes in atrial myocytes (AMs) is significantly different and much less understood. Taken together, quantitative structural characterization of TATS membrane networks in healthy and diseased myocytes is an essential prerequisite towards better understanding of functional plasticity and pathophysiological reorganization. Here, we present a strategic combination of protocols for direct quantitative analysis of TATS membrane networks in living VMs and AMs. For this, we accompany primary cell isolations of mouse VMs and/or AMs with critical quality control steps and direct membrane staining protocols for fluorescence imaging of TATS membranes. Using an optimized workflow for confocal or superresolution TATS image processing, binarized and skeletonized data are generated for quantitative analysis of the TATS network and its components. Unlike previously published indirect regional aggregate image analysis strategies, our protocols enable direct characterization of specific components and derive complex physiological properties of TATS membrane networks in living myocytes with high throughput and open access software tools. In summary, the combined protocol strategy can be readily applied for quantitative TATS network studies during physiological myocyte adaptation or disease changes, comparison of different cardiac or skeletal muscle cell types, phenotyping of transgenic models, and pharmacological or therapeutic interventions.

Introduction

건강한 횡문근 세포에서 세포 주 축에 수직 "횡"방향 (T-세뇨관)와 관형 막 구조는 풍부하다. 결과적으로, T-세뇨관 깊게 셀 중심쪽으로 세포질 침투 근육 세포 주 "측"표면 막 (sarcolemma)의 지속적인 확장으로 특성화되었다. 외면 막 연속 T-세뇨관의 생리 학적 역할은 전압 – 활성화 된 L-타입 칼슘의 나노 근접 결합에 의해 비교적 큰 심장 근육 세포 부피에 걸쳐 SER 소기관 접촉 영역에 의해 형성 원격 세포 내 구획의 급속한 전기적 결합이다 2+ 채널 인접 ryanodine 수용체 (RyR2) SER 칼슘 릴리스를 활성화 전류 (I CA) 안쪽 (Cav1.2). 접합부의 SER 도메인과 T 사이의 심실 근세포 (VM에), 비 연속 막 친구 ( "접합")에-tubules는 각 셀에 하나의 개별 세포 내 칼슘 릴리스 nanodomains의 수천을 제어 할 것으로 생각된다.

주어진 도메인에 대해 접촉, 병치 막 부 T-세관과 주연 (접합부) SER 각각은 서로 가까이 15 nm의 nanodomain 그러므로 정의는 대략이다. 따라서, 아주 작은 개인의 세포질 부분 공간은 준 세포 자율 구획 동작을 가능하게하는 분리된다. 들어오는 활동 전위가 VM을, 상대적으로 작은 칼슘의 T-세관에서 Cav1.2 채널을 활성화하면 2 + 안쪽으로 전류가 빠르게 attoliter 크기 nanodomain 하나의 부분 공간 칼슘 농도 [칼슘] S 증가합니다. 다음에, [칼슘] 2 + S 증가 -gated ryanodine 수용체 (RyR2) 병치 SER 막 접합에 나노 미터 근방에서 칼슘을 활성화하고,이 결합 프로세스는 모두 전기적으로 연결 걸쳐 발생D의 심근 nanodomains. RyR2s 5-10 RyR2 채널이 1 Cav1.2 채널 추정 화학량 론과 같은 고밀도 멀티 채널 클러스터를 발생한다. SER 대 세포질 때문에 [CA는 2 +] 구배는 매우 가파른 (비율 10 4 : 1)이고 RyR2s 기능적으로 결합 된 클러스터에서 높은 컨덕턴스 칼슘 방출 채널 기능, 정량적 큰 칼슘에 RyR2 활성화 결과 2+ 1-2 밀리 3,4에서 100 μM 이상으로 [칼슘 2 +] S 지역 부분 공간을 증가 T-세관 결합 접합부의 SER 도메인의 현재 놓습니다. 이 심장 신호 증폭 동작은 또한 칼슘 릴리스 (CICR) 유도 칼슘 2라고합니다. 이와 함께, T-세관 빠르게 여기 수축 (EC) 커플 링 중 접합부 nanodomain의 SER 연락처와 세포 전체 CICR을 통해 칼슘 방출 신호를 활성화 필수적인 막 구조이다.

T-세뇨관에 더하여, 축 세뇨관메인 (종 방향) 셀 축에 상당히 상이한 방향에 평행으로 S (A-세뇨관)는 전자 현미경 (EM) 및 공 초점이 광자 현미경 연구에 의해 설명되었다. 예를 들어, 근절의 Z-라인 근처에 T-세관과 상호 근원 섬유 사이의 A-세관의 셀 전체의 연속 격자 세포 추적자 고정 기니 돼지의 VM (5)의 EM 영상으로 표시했다. 세포 외 덱스 트란 연결된 형광 염색법을 사용하여 쥐의 VM의 2 광자 이미징을 살고, 복잡한 망상 3D 세관 네트워크는 ~ 60 % T-세관 및 ~ 40 % A-세관 6 이루어진 시각화했다. 이 연구는 또한 EM 시각화 단면하는 것은 본질적으로 가로 축 세관 시스템 (TATS)와 같은 복잡하고 역동적 막 네트워크의 분석을 위해 제한되어 있음을 실현, 풍부한 A-세관의 3D 시각화에지도하지. 따라서, TATS 세포막의 공 초점 라이브 세포 이미징 직접 염색 디 – 8 – ANNEPS이 개발되었다. 만약 라이브 셀TATS 네트워크는 푸리에 변환에 의해 분석되고, 근절의 Z-선 근처의 공간에서 T-세뇨관 성분의 정규 외관 줄이있는 신호들 (7)의 영역에서 앙상블 파워 스펙트럼에 의해 반사된다. 이 간접 분석 전략은 질병 모델 7 TATS 컴포넌트 규칙에서 셀 전체의 지역 변경을 검출하기 위해 사용되어왔다. 예를 들어, shRNA를 매개 junctophilin-2 노크 다운 심부전 및 이소 특정 단백질 결핍 nanodomain 칼슘 방출 장애 8 T-세관 개편 결과가 발생했습니다. 우리는 최근 직접 정량 방법을 통해 더욱 유도 방출 고갈 (STED) nanoscopy 9를 사용하여 마우스의 VM에서 TATS 개별 성분의 생균 수퍼 해상도 현미경 TATS 막 네트워크 분석을 확장 하였다. 횡 방향의 분포를 대략 50:50 작은 TATS 개별 성분의 직접 분석에 허용 나노 이미지 해상도축 세관 방향 대, 정량적으로 건강한 마우스 마음 9이 풍부한 아직 차동 중심의 개별 TATS 구성 요소를 확인. 이러한 전략은 아래에 더 프로토콜 절에서 설명 될 것이다.

성인 심장의 풍부한 A-세관 구성 요소의 생리 학적 역할은 수수께끼 남아있다하지만, EM 연구는 2 + 내인성 칼슘 기니 돼지와 쥐 VM을 5, 10에서 릴리스 nanodomains을 제안 A-세관과 관련된 SER 막 구조를 설명했다. Cav1.2 RyR2 및 공 촛점 분석은 A-10에 접합 세뇨관 colocalization을 높은 수준을 발견 하였다. VM이 T-세관은 일반적으로 발생하는 Z-라인 줄무늬에서 비교적 멀리 떨어져 유래 쥐에 자연 칼슘 스파크 ~ 20 % 때문에, 하나의 인수는 A-세관 관련 nanodomains이 실제로 존재하고 기능 수있다 칼슘 릴리스 사이트 등 11, 12. 흥미롭게도, T-세관 형성과 성숙 OC단 생후 CURS 및 P5에 전구체 sarcolemmal의 함입의 발아 내지 예 심근 세포의 성장을, 평행 및 미성숙 쥐 13 P10에서 TATS 네트워크 어셈블리 분지. 그것은 Junctophilin-2 shRNA를 노크 다운 이후 출생 TATS 네트워크의 성숙에 중요합니다 지연 칼슘 릴리스와의 미성숙 A-가느 다란 관 지배 구조와 일치 병리학 TATS 조직에 선도적 인 SER 접합에 T-세관 세포막의 고정을 방지 나타납니다 VM을 13. 이러한 관찰은 궁극적으로 개념 증명 T-세관 추가 또는 대체 세포 내 메커니즘 (14)를 통해 변신 할 수 있습니다 A-세관 반면 막 함입의 과정을 통해 형성 될 수 있습니다.

심장 질환의 TATS 막 변화의 특성은 병태 생리 학적 질문에 대한 중요한 연구 분야가되고있다. 페이싱에 의한 심장 failu의 개 모델의 초기 보고서다시 T-세뇨관 Cav1.2 및 전류 (I CA) (15)의 손실을 보였다. 허혈성 심근 병증의 돼지 모델은 T-세관 밀도를 감소 보였다 세포 내 칼슘의 감소 된 동시성 (16)를 해제 2 +. 심부전 자발적으로 고혈압 래트 (SHR) 모델을 이용하여, T-세뇨관의 손실 "orphaning RyR2"의기구에 의해 제안 된 Cav1.2 RyR2과의 커플 링을 감소 nanodomain 연관되었다 (7). T-세관의 손실 또한, 허혈성 확장 성 및 비후성 심근 병증 샘플 17에서 인간의 VM에 표시되어 있습니다. 또한, A-세뇨관의 증가는 인간 동공 심근증 (18)의 조직 섹션에보고 하였다. 심근 경색에 따라, 우리는 A-세뇨관 요소 (9)의 증가에 대비 T-세뇨관의 상당한 감소와 마우스의 VM에서 TATS 재구성 차동기구를 보였다. 중요한 것은, 개선 지역의 막 대비 생균 superre을 통해 달성용액 STED 현미경 전반적인 TATS 네트워크 길이의 증가 및 복잡성 9 분파와 A-세뇨관 상당한 증식을 보였다 직접적인 측정을 통하여 정량 상세한 성분 분석 할 수 있었다. 또한, 심근 경색 19 후 심장 재 동기화 치료는 심방 tachypacing에 의한 심장 마비 (20) 개에 T-세관의 리모델링을 반전으로 이어질 수 있다는 것을 쥐의 T-세관 리모델링을 반전 할 수 있습니다 그 운동 훈련으로 넘어졌습니다. 프로토콜에 설명 아래 부분 결과로 함께 촬영, 병에 걸린 사람과 동물의 VM을뿐만 아니라 잠재적 인 치료 개입의 두 연구는 틀림없이 높은 품질의 세포 격리 절차 및 세부 정량 분석​​ 전략에서 도움이 될 것입니다.

KATP 채널의 TATS 막 인신 매매 21 이소 폼 대 측면에 의해 최근에 입증 더욱이, 그것은 심방 m를 고려하는 것이 중요하다yocytes 생물학적으로 구별뿐만 아니라 VM을 대 비교 심장 세포 모델로 (AMS). T-세관은 최근 양, 인간의 AMS (22)에 설명 하였다. 현재 증거는 몇 T-세관이 작은 설치류 (23) 양, 인간,하지만 같은 큰 포유 동물에서 일반적으로 AM 세포에 존재하는 것이 좋습니다. VM을 달리 AMS에서 세포 내 칼슘 방출 2+ 표시 시공간 칼슘 결과 23 그라디언트 셀 중심을 향해 확산에 의해 세포 표면에서 발생하는 전파 나타난다. 이 프레임 워크 내에서 그와 같은 심방 세동 (24)로 세포 내 칼슘 일반적인 질병 형태의 불안정성 신호의 메커니즘을 규명하는 것이 중요 보인다. 요약하면, 건강하고 병에 걸린 마음 모두 AM 및 VM 세포 분리 및 각 일반적으로 프로토콜을 사용된다. 충분한 셀 품질의 미세한 문서에 의해 판단으로 세포 격리가 제대로 수행되는 경우에만, AM 및 VM 샘플은 캘리포니아해야양적 TATS 분석을 위해 앞으로 rried. 따라서, 다음과 같은 프로토콜 섹션은 마우스 또는 그대로 TATS 세포막을 분석하는 라이브 셀 현미경으로 다음에 다른 종에서 분리 된 높은 품질의 세포에 매우 의존한다. 이전에 지적한 바와 같이, TATS 멤브레인의 특성은 고정 및 준비 유물 6, 삼투압 변화로 인해 막 변경 및 기존의 광학 현미경 9의 해상도 제한에 대한 성향을 가진 도전적인 연구 영역이다. 우리는 칼슘 이미징 및 패치 클램프 및 세포 배양에 대한 쥐의 VM 인간의 AMS의 분리를위한 최근의 최첨단 프로토콜 이전에이 일기 (25), (26)에 발표되었다 있습니다.

Protocol

주 : 모든 동물의 절차를 검토하고 실험 동물의 인도적 관리 및 사용을 준수 대학 의료 센터 괴팅겐의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 마우스 심장의 심방과 심실 근세포의 1 절연 가능한 한 조심스럽게 동물을 처리하고 승인 된 프로토콜에 따라 격리 된 심장 세포에 대한 신경 호르몬 과잉 잠재적 강력한 부주의 효과를 피하기 위해 특별히 일반적으로 스트레스를 최소화 할 수 있습니다. 또한, 헤파린 (500 IU / kg 체중 피하) 상당히 분리 중에 심근 세포의 수율 및 무결성을 손상시킬 수있는 혈액 응고 및 마이크로 색전을 방지하기 전에 심장 추출에 적어도 20 분 각 마우스를 주입. 12 주 또는 이소 플루 란 흡입 세 이상 쥐를 마취 통증 철수 반사의 유무를 확인하고, 자궁 전위에 의해 동물을 안락사. 신속하게 이전에 설립 된 전문 프로토콜을 다음 심장의 압축을 풉니 다 (예를 들면, Kaestner 등. 26 Louch입니다 등. 27 참조). 불필요한 압착 또는 스트레칭으로 심방에 대한 실수로 손상을 피하십시오. 조심스럽게 성공적인 삽관과 심장의 재관류에 중요 대동맥 혈관 벽을 통해 횡 연속 절삭 날을 확립 루터 집게 직선 가위를 사용하여 근위 대동맥의 조직을 보존. (솔루션은 표 1 참조를 위해) 얼음처럼 차가운로 즉시 명목상 칼슘 무료 관류 버퍼를 적출 심장을 전송합니다. 마음이 완전히 침수 될 때까지 실수로 공기 색전증을 방지하기 위해 버퍼에 공기를 통해 전송하는 동안 고정 큰 혈관을 유지합니다. 심장 수축을 억제하는 버퍼와 얼음 냉각 솔루션 BDM을 사용합니다. 충분한 차원 ILLUM와 크게 쌍안 현미경을 사용ination. 완전 버퍼로 가득해야하는 (정상 마우스의 심장 무게에 대한 외경 0.81 mm) 매끄러운 표면과 마음의 파노라마 입체에서 대동맥을 Cannulate 21 G 정맥을 연마. 신속한 용액 흐름 제어를 허용 2 방향 밸브를 통해 루어 근위 용액 저장조 (예, 주사기)를 접속함으로써 캐 뉼러에 기포가 없음을 확인. 정맥은 대동맥 밸브 및 관상 동맥의 가지 위에 약 1mm 인 대동맥 내부에 올바르게 배치되었는지 쌍안경 배율에서 확인합니다. 물론 모든를 통과 또는 정맥과 대동맥 밸브의 실수로 천공 (이 영구적 대동맥 판막 폐쇄를 방해하고 결과적으로 심장 혈류를 방해한다)하지 마십시오. 이 실크 봉합사를 사용하여 정맥의 끝 부분에 맞춤 제작, 원주 중심의 미끄럼 방지 홈에 부드럽게 대동맥 타이. 관상 arteri을 방류하지 마십시오어느 시점에서 강제적으로 싸기. (; 아래도 토론 섹션을 참조하거나 일정한 압력 또는 일정한 흐름을 사용하여) 솔루션 가득 정의 및 사전 조정 관류 시스템의 꽉 조이는 유출 커넥터에 대동맥과 심장에 묶여 정맥, 수정 랑겐 돌프 설치 일명 연결합니다. 37 ° C (4 ㎖ / 분 대상 관류 속도)에서 산소 관류 버퍼를 사용하여 4 분 동안 가능한 한 빨리 마​​음을 관류. 37 ° C에서 8 ~ 10 분 동안 소화 버퍼 (600 U / ㎖의 콜라겐 유형 II)를 포함하는 콜라게나하는 재관류를 전환하여 소화를 시작합니다. 명백한 심장 표면에 걸쳐 증가 불투명, 부드러움, 그리고 발기를 포함하여 유사한 조직 변화를 확인하여 조직 소화의 진행 상황을 모니터링합니다. 필요한 다음 소화와 심장 챔버를 해부하다. 쌍안 현미경 유관 마음을 놓고 후방 마음의 벽을 시각화. 잔류 비 심장 조직, 예를 들면, 폐를 해부하다ND 선박 부품, 마이크로 가위를 사용하여 분해 완충액 세포의 오염을 방지하기 위해 (예를 들면, 8mm 직선 블레이드 스프링 위)도 1에 도시 된 바와 같이. 콜라겐 분해 마음의 특정 챔버, 지역 및 / 또는 세포를 수확한다 체크리스트 (그림 1) 수행 및 / 또는 우심방, 무료 왼쪽 및 / 또는 오른쪽 심실 벽, 및 / 또는 심실 중격 떠났다. 특정 심장 조직의 절개를 들어, 실리콘 수지 엘라스토머 몇 mm 두께의 층으로 코팅 비교적 넓고 평평한 해부 욕을 사용한다. 바닥 탄성 중합체 층에 미세 곤충 강철 핀 마음의 정점을 수정합니다. 우심방을 편향 그냥 방실 밸브 위의 우심방을 해부하다. 좌심방과 절개를 계속합니다. 해부 및 섬유 밸브 장치를 폐기합니다. 마지막으로, 좌측 및 우측 자유 심실 벽과 격벽 및 / 또는 작은 해부조직 부품 어 필요에 따라. 연수생 만 주 : 비 소화 마우스 마음으로 시작, 연습을 얻을 수 있습니다. 해부학 적 방향의 편의를 위해 콜라겐 분해 마우스 마음으로 계속 그림 1과 같이 양안에서. 3D 해부학 일단, 수동 처리를 양안 아래의 모든 연속 해부 단계를 포함하는 조직 처리를 연습하고, 해부 단계는 충분히 익숙해 아르 위 설명했다. 심실의 심근 (VM) 세포 격리의 경우 : 신선한 소화 버퍼의 2.5 ML로 심실 조직을 전송합니다. 여러 장기의 부품, 예를 들면, 심방 및 심실로부터 동시 셀 아이솔레이션이 시도되는 경우, 두 번째 사람은, 셀 분리 수순의 다리에 걸릴 수 모두 최소화하고 다수의 심장 조직의 조정 처리를 통해 마우스의 사용을 최적화하기 위해. 단계 이후 1.10 1.9.1-1.9.4, 계속합니다. 전체 심실 조직 중 하나를 해부하다또는 특정 부분품 (예를 들어, LV, RV, 무료 벽, 및 / 또는 격막) 날카로운 가위를 사용하여 2.5 ml의 소화 버퍼에 약 1mm 3 조각으로 (예를 들어, 8mm 직선 블레이드 봄 가위) 60mm 페트리 접시에 . 부드럽게 피펫 전사 조직 조각 느린 저작하여 세포 현탁액으로 VM을 해리. 세포 현탁액에있는 에어 버블을 피하십시오. VM 세포 현탁액에 정지 버퍼의 8 ML을 추가하고 15 ML 원뿔 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다. 나머지 조직 조각을 약 15 초 동안 바닥에 정착 할 수 있도록 허용하지만, 서스펜션에 남아 고립 된 세포에 충분한 짧은. 다음에, 15 ㎖의 새로운 튜브에 상청 양의 전송을 통해 VM 현탁액을 수확. 과도한 조직 조각이있는 경우, 또는 세포 현탁액으로부터 조직 조각들을 분리하는 최소 200 μm의 이격 나일론 메쉬를 사용한다. VM 세포 현탁액을 15 ㎖의 공동의 바닥에 정착하자8 분 동안 중력에 의해 nical 관. 단계를 씻어 : 상층 액을 제거하고 부드럽게 관류 완충액에 남아있는 VM 펠렛을 재현 탁. 반복 세척 단계 1.9.5 (옵션 : 점차적으로 필요에 따라 칼슘 농도를 증가하기 위해 추가 세척 단계를 추가). 10 ㎖의 관류 완충액에 정착 VM 펠렛을 재현 탁하고 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 (튜브 당 약 50,000 세포 VM)에 남아있는 세포 현탁액 부피를 분산. 심방 근육 세포 (AM) 세포 격리의 경우 : 신선한 소화 버퍼 1 ㎖로 소화 / 해부 심방 조직을 전송합니다. 작은 페트리 접시 (예를 들면, 60mm 직경) 마이크로 가위를 사용하여 1 ml의 소화 버퍼에 약 1mm 3 조각으로 부분적으로 소화 심방 조직을 잘라. 부드럽게 유체 제트 손상을 피하기 위해 잘라 팁 1 ml의 플라스틱 피펫을 사용하여 분쇄 세포 현탁액으로 소화 조직 조각에서 AM 세포 해리. 중분쇄는 엄격하게 세포 현탁액에있는 에어 버블을 피하십시오. 세포 현탁액에 남아있는 콜라게나 제 활성을 체포 (10 % BCS 50 μM 염화칼슘 2) 기계 교반 후, 정지 버퍼의 4 ML을 추가합니다. 15 ML 원뿔 튜브에 AM 세포 현탁액을 전송합니다. 나머지 조직 조각을 약 15 초 동안 바닥에 정착 할 수 있도록 허용하지만, 서스펜션에 남아 고립 된 세포에 충분한 짧은. 15 ㎖의 새로운 튜브 용액 전송 통해 무료 AM 세포를 함유하는 상등액을 수확 볼륨. RT에서 AM 세포 현탁액, 예를 들면, 20 XG에 2 분 원심 분리기 또는 – 바람직 막 연구에 – 세포가 15 ML 원뿔 튜브에 20 분 동안 중력에 의해 서서히 정착 할 수 있습니다. 5 ㎖의 관류 버퍼의 AM 펠렛을 재현 탁 조심스럽게 상층 액을 제거하고 단계를 씻으십시오. 1.10.4를 반복합니다. 재현 탁 AM 세포를 부드럽게 5 ML의 관류 버퍼. 1.5 ML의 마이크로 원심 욕조에있는 세포 현탁액 볼륨을 배포ES (튜브 당 약 1000 AM 세포). 분석하고 트리 판 블루 염색을 이용하여 세포 수율 포함하여 각 심장 절연 세포군 품질을 문서화. 이를 위해, 1로 세포 현탁액 500 μl를 희석 : 1ml를 잘라 피펫 팁을 사용하여 1 부피 / 부피과 트리 판 블루 용액 (최종 농도 0.02 %)를. 매우 / 아래로 피펫을 느리게하여 부드럽게 세포와 트리 판 블루를 섞는다. 즉시 사이토 개선 노이 바 우어 형에 세포 현탁액을 포함하는 트리 판 블루를 적용하고 거꾸로 현미경을 사용하여 그대로 근육 세포를 계산합니다. 명백한 손상, 막 기흉, 세포 내 트리 판 블루 (그림 2) 축적 중단 줄무늬, 경축, 그리고 세포와 모든 세포를 제외합니다. 또한 자발적으로 이후의 세포 사멸에 취약 세포를 계약 제외합니다. 현탁액 그대로 세포의 수를 평가하기에 걸쳐 블루 트리 판 제외 일반 줄무늬 만 심장 근육 세포를 사용세포 부피. 투과광 현미경에 의한 개별 심방과 심실 근세포의 무결성을 판단. 문서 및 추가 분석을 위해 tif 여야 파일로 시야 이미지를 저장합니다. 심장 세포의 무결성 분석을 위해 다음과 같은 기준을 사용 가시 세포 부피에서 일정한 줄무늬의 존재를 확인; 두 세포 측면의 측면 막 근육 섬에 평행의 지속적인 무결성을 확인; 표면적 막 구조의 무결성을 모두 반영하는 셀 양쪽 인터 디스크 날카로운 톱니 시각화; 및 다음 기본 셀 고유의 시야 이미지 형태 (예를 들어, 오버레이 복합 IMAG로 ImageJ에와 두 이미지를 결합하는 현지화 상관 관계 3 절에 설명 된대로 TATS 막의 형광 신호 (또는 immunolabeled 카베 올린 3 단백질 또는 다른 막 마커)를 시각화전자). 시야 이미지에서 근절 길이를 결정합니다. 평균 근절 길이 순차적으로 정렬 된 줄무늬 근절의 거리를 측정하고, sarcomeres의 숫자로 거리를 나눈다. 셀 당 적어도 두 위치를 측정한다. ImageJ에와 상용 소프트웨어 또는 오프라인으로 분석을 수행합니다. 참고 : 언 커플 링 에이전트로 치료하는 경우, 마우스 마음에서 그대로 편안 VM이 ~ 1.9 μm의 28의 평균 근절 길이를 보여줍니다. 투과광 현미경 이미지에서 형태와 개별 심방과 심실 근육 세포의 크기를 정량화. AM 및 VM 세포의 크기가 유의 한 차이가 있음을 고려한다. 셀 길이, 폭 및 면적을 측정하고, 길이 계산 : 폭 비율. 명령 다각형 선택 도구를 사용 ImageJ에의 투과광 화상으로부터 2D 셀 사이즈를 분석하고도 3을, ROI 매니저 유사한 추가. 형태학 경우 Changes 특정 연구 컨텍스트 내에서 예상되는 모든 셀들에 대한 상기 문서의 특정 마우스 균주, 연령, 성별, 심장 크기 및 후속 데이터 분류에 대한 개입. 생활 심방과 심실 근세포에서 TATS 멤브레인의 2 염색 촬상 챔버 부하 (예를 들면, POC-R2) 42mm 유리 커버 슬립으로. 커버 슬립 안정 심근 첨부 파일의 경우, 생리 관류 버퍼 (최종 농도 0.2 ㎎ / ㎖)의 라미닌 스톡 1:10 희석 라미닌 용액 20 μl를 준비합니다. 유리 커버 슬립에 균등하게 라미닌 용액 20 μl를 확산. 관류 버퍼에 50 μM 디 – 8 – ANEPPS 용액 800 μl를 준비합니다. 이를 위해, 780 ㎕의 생리 학적 완충액에 2 mM의 디-8-ANEPPS 스톡 용액 20 μl를 희석한다. VM을 염색하기 위해, 세포 1.5 ㎖의 반응 관에서 8 분 동안 중력에 의해 해결하자. AMS 얼룩, 하나 중력 침강 또는 SP를 사용하려면2 분 동안 세포 현탁액 (1.10.3 참조). 세포 펠렛의 불필요한 교반을 회피하면서 AMS 및 VM을 모두 조심스럽게 상층 액을 제거하고 800 μl를 부드럽게 용액 (50 μM)을 함유하는 디-8-ANEPPS에서 세포 펠렛을 재현 탁. 즉시 촬상 챔버 라미닌 – 코팅 된 커버 슬립 상에 디-8-ANEPPS가 / 심근 세포 현탁액을 전송. 어둠 속에서 실온에서 15 분 동안 VM 현탁액을 얼룩. 천천히 수동 ​​피펫 이미징 챔버의 측면에서 위쪽으로 유체 메 니스 커스 (meniscus)를 통해 과도한 볼륨을 제거합니다. 대부분의 디 – 8 – ANEPPS 스테인드 근육 세포가 단단히 라미닌 – 코팅 된 커버 슬립에 부착 된 상태로 유지하고 공기에 노출되지 않는 것을 확인합니다. 그 다음, 천천히 비 부착 세포를 포함한 모든 과량의 유체를 제거 하였다 관류 완충액 1 ㎖를 첨가하여 한번 부착 심근 현탁액을 씻는다. 조심스럽게 천천히 t 측으로부터 관류 완충액 1 ㎖와 염색 표면 부착 근세포 오버레이그는 챔버 이미징. 현미경 무대에 영상 실을 배치합니다. 생활 심방과 심실 근세포에서 TATS 막 구조의 3 이미징 일반적으로, 신중하게 TATS 막 영상에 사용할 수있는 최상의 형광 현미경 옵션 (들)을 선택합니다. 공 초점 이미징의 경우, 최근의 생성, 최적화 된 PMT 배열 검출기 및 형광 신호 강도를 극대화 광자 재활용 경로 현대 형광 현미경을 고려하십시오. TATS의 작은 세부 사항의 공 초점 이미징은 막 구조는 63X 1.4 NA 오일 목적 또는 사용 – 예약 상황에 따라 -. 고의 일반 원칙에 대한 콜 등 34에 의한 심근 특정 응용 프로그램에 대한 검토로 작은 TATS 세부 사항에 대한 STED의 수퍼 해상도 현미경을 사용하여 고해상도 형광 현미경은 토론 섹션을 참조하십시오. 이상적으로 모든 디-8-ANEPPS 염색 세포를 MEM 점유율을 검출하는 촬상 파라미터를 설정주어진 심근 촬상 평면 내부 branes. 최대 레이저 파워의 3 %에서 458 nm의 여기 예] : 공 초점 레이저 주사 현미경을위한 출발점으로 다음 파라미터를 사용 550 nm에서 740 nm의 사이의 방출 신호를 감지; 검출기 이득 (예를 들어, 마스터 명령 800); 900 nm 인 광학 슬라이스 두께 핀홀 한 AU. 신호 – 대 – 잡음을 최적화하기 위해 이러한 파라미터들을 조정한다. 적절한 (그림 4a 및도 4b)로 그대로 AM 또는 VM의 셀을 선택합니다 시야 모드를 사용합니다. 셀 전체 일반 줄무늬와 동일한 근절 간격, 날카로운 표면 가장자리 톱니 네 셀 측에, 측면 막의 지속적인 무결성 및 부재 : 요약 된 바와 같이 셀을 선택하는 셀의 무결성을 판단하는 방법을 관련 기준에 1.12을 가리 키도록 참조 어떤 막 기흉. 심근 세포 중앙 섹션의 샘플 이미지를 취할. ROI는 "자르기"기능 →를 사용하여 조정하려면; 최종 픽셀 크기가 100 나노 미터 × 100 나노 미터를 측정 → 자르기 창을 조정합니다. 심근의 주요 (축 / 세로) 축과 일치하도록 자르기 창의 x 축 조정. 최종 영상 평면을 선택합니다. 수동 Z 방향 적절한 촬상 평면을 선택하는 하나의 영상 프레임을 사용한다. T-세관 및 A-세관 구성 요소를 포함하여 TATS 막은, 초점면에서 시각적으로 알 수 있는지 확인합니다. 전형적인 세포 이미징 평면 세포 기준점으로 핵을 포함 할 수 있습니다. 도 4a 및도 4b의 예를 참조하십시오. 주 : 일반적으로, 가능한 한 짧은 레이저 광에 대한 세포의 노출을 유지한다. 가능하면, 심장 근세포에서 최적의 초점 평면을 결정하는 하나의 영상 프레임을 사용한다. 약 0.5 마이크로 초에 픽셀의 정지 시간을 조정합니다. 16 배속 평균을 선택하고 스냅 샷으로 이미지를 기록한다. 적절한 이미징 평면을 설정하는 화상 스냅 샷 단계를 반복필요에 따라 3.5에서 TATS 막 구조에 대한 윤곽 s는. 최종 이미지를 저장하고 파일의 대상 폴더에 저장되었는지 확인합니다. 일반적으로, 분석 소프트웨어의 균일 한 적용을위한 동일한 형식 (예 : LSM)에서 모든 이미지 파일들을 저장한다. 이전 모든 이미지 분석을 다시 한 번 (단계 1.12.1 아래에 나열된 기준을 고려) 오프라인 충분한 세포의 무결성을 확인하고 분석에서 손상된 세포를 제외합니다. 도 4C와 4D의 예를 참조하십시오. TATS 멤브레인 네트워크 및 그 구성 요소의 분석 (4) TATS 세포막 성분의 직접적인 분석을위한 다음의 화상 처리 단계는도 5a 및도 5b에 하향식 플로 다이어그램과 같이 요약된다. 피지 (http://fiji.sc/)에서 디 – 8 – ANEPPS 스테인드 심근의 이미지 파일을 열고 ImageJ에의 자유롭게 사용할 수 변형에 필수적인 분석 플러그인을 포함하는이미지 처리. 자세한 내용은 Schindelin 외 29를 참조하십시오. → 다른 이름으로 저장 tif 여야 → 이미지 → 파일을 저장합니다. TATS 막 성분을 분석하기 위해, 도시 된 바와 같이 다음 ROI 테두리 외면 막 (sarcolemma)를 제외하고 TATS 점막의 세포 내 부분을 포함하여 서술하는 "다각형 선택"툴을 사용하여, 외부 표면 막 신호 제외한 적절한 ROI를 선택 도 5a (ROI). → 도구 → 투자 수익 (ROI) 관리자를 분석 적용하여 "투자 수익 (ROI) 관리자"를 선택한 ROI를 추가합니다. , TATS 성분의 방향 분석을위한 특정 ROI를 선택하는 기본 셀 길이 방향 축과 평행 화상 X 축 정렬한다. 셀이 약간 굴곡이있는 경우, 여러 가지의 ROI를 선택하고 개별적으로 투자 수익 (ROI)을 맞 춥니 다. 분석에서 어떤 핵을 제외합니다. 분석에서 과도하게 곡선 세포를 제외하기 때문에 R의 정확한 정렬OIS는 점점 어려워지고, 분석하는 동안 방향 오류를 증가시킬 것이다. 외부 표면 막에서 원치 않는 신호 정보를 삭제 : 편집 → 지우기 외부 "를 선택한 ROI"(그림 5A)를 생성 할 수 있습니다. 선택된 ROI 만 TATS 네트워크에 해당하는 세포 내 막 부분이 포함되어 있는지 확인합니다. 도 5a에서 설명하는 바와 같이 후속 정량 분석에 앞서 이미지 처리 단계 (명령)의 체인의 다음을 수행한다. 빼기 배경 → → 프로세스를 클릭하십시오. 5 픽셀로 롤링 볼 반경을 설정합니다. NOTE : 이미지 분석 X 100 내지 100nm의 화소 사이즈가 될 경우, 5 화소에 롤링 볼 반경을 설정한다. 다른 픽셀 크기를 들어 약 500 nm의 반경에 대응하는 물리적 픽셀의 수와 볼 롤링 반경을 설정한다. 로컬 대비를 강화 → → 프로세스를 클릭 (CLAHE). , 256, 49 세에 최대 경사, 그리고 "없음"에 마스크를 히스토그램 쓰레기통 블록 크기를 설정합니다. 부드러운 → → 프로세스를 클릭하십시오. → 플러그인 → 분할 → 통계 지역의 병합을 클릭합니다. 쇼 평균 클릭 → Q100에 매개 변수를 설정합니다. 통계 영역의 완전한 처리를 확인하는 새로운 이미지 프레임의 자동 발표로 표시와 라벨의 "SRM의 Q = 100"이 나타나는 것을 확인 병합. 이 이미지 파일을 사용하여 다음 단계를 계속합니다. → 이미지 → 형 → 8 비트를 클릭하십시오. → 임계 값을 조정 → 이미지 → 클릭합니다. 낮은 신호 강도 TATS 성분의 특정 않도록 배제 대부분을 검출하기에 충분히 낮은 임계 값 이상적으로 모든 TATS 구조 등을 선택 (출발점 (40)의 임계 값을 사용한다). 그림 6에서 "대표 결과"섹션 상세한 데이터 출력 및 예제를 참조(255의 상위 임계). 임계 값 매개 변수의 최종 선택을 문서화하십시오. 임계 값의 적절한 선택에 의한 배경 잡음에 거짓 양성 신호를 특정 TATS 막 구조물을 생산할 수 있지만 유의한다. 골격 구조의 (표시) 연속성과 일치해야합니다 중간 및 높은 형광 신호 레벨에 대한, 특히 추출 된 골격 데이터, 대 TATS 이미지 세부 사항의 올바른 중첩을 확인합니다. 적절한 임계 값이 확인되면, 분석하는 동안 사진이 동일한 임계 값을 적용하고 골격 데이터 일관성이 바이어스 전위 소스를 최소화 대 원래 신호의 중첩 비교를 반복한다. 적용에 → 클릭 "임계"아래도 5에 도시 한 바와 같이 화상 데이터가 이진된다. → 클릭 플러그인 → 해골 → 해골로 (2D / 3D). tif 여야 의해 파일로 (도 5에 도시 된 바와 같이) 2 차원 골격 화 화상을 저장→ tif 여야 → 다른 이름으로 저장 파일 → 클릭. 플러그인 → 클릭하여 정량적 데이터 출력을위한 골격 화 이미지 파일을 분석 → 해골 (2D / 3D)를 분석 할 수 있습니다. 없음 : 자두주기 방법을 선택합니다. 얻어진 데이터 테이블의 자동 생성을 확인한다. txt 파일로 자동으로 생성 된 데이터 테이블을 저장합니다. 중요한 예는 정량적 파라미터 선택 분기점의 총 수 또는도 7에 예시 된 데이터로 나타낸 바와 같이 분기 평균 길이. 상보 / 지원 소프트웨어 툴 엑셀과 같은 적절한 데이터와 상기 분석을 고려한다. 개별 이미지 및 / 또는 이미지 일괄 사이의 분석을 조화 4.5에 설명 된 필요한 모든 조치를 포함하여 가능한 자동화 된 이미지 처리 루틴을 사용하는 것이 좋습니다. 피지 프로그래밍 이미지 처리 매크로 (필요에 따라 프로그램을 조정)이 포함 된 예를 보충 코드 파일을 사용합니다. 의 분석"방향성"을 플러그인 피지에 의한 골격 화 된 이미지 데이터로부터 모든 선택하거나 TATS 네트워크 구성 요소의 대해 개인적인 방향. 각각의 축 방향으로 지향 A-세관 또는 횡 방향 T-세관 구성 요소가 0 ° 또는 90 ° 쓰레기통으로 표시됩니다 방향성 히스토그램을 생성합니다. 이미지 방향의 정확한 기준을 참고하고는도 8과 대표 결과에 나타낸 바와 같이 VM 셀의 주 (종 방향) 0 ° 축과 밀접하게 대응하여 이미지의 x 축에 대한 중요하다. 에 → → → 방향성이 방법 지정 Analyze (분석)를 클릭 : 푸리에 구성 요소를 Nbins (180)는 히스토그램은 -45 → 시작 디스플레이 테이블을 클릭합니다. txt 파일 등 관련 히스토그램 데이터를 포함하여 새로 생성 및 표시 결과 테이블을 저장합니다. Excel과 같은 필요에 따라 무료 소프트웨어 툴에 의해 txt 파일 데이터의 추가 분석을 고려하십시오. 의 서브 클래스를 생성하려면동일한 조건 (및 잠재적으로 다른 조건) 하에서 처리 된 모든 셀에 대해 그룹화 된 데이터 세트 등과 같은 데이터 분석이 적절하게 모든 관련 이미지 4.1-4.7 단계를 반복한다. 평균 값을 유도하기 위해 결합 된 하나 엑셀 파일로 사진 골격 화 데이터로부터 파라미터를 가져. 또한, 계산 평균 방향성 히스토그램을 생성하기 위해 결합 된 엑셀 파일로 그룹화 동일한 데이터 집합으로부터 모든 방향성 히스토그램 데이터를 가져. 필요에 따라 개별 또는 사이에 다른 치료 그룹에 대한 관심의 추가 TATS 네트워크 매개 변수를 분석하기 위해 그룹화 된 데이터 세트의 추가 처리를 생각해 보자.

Representative Results

또한 TATS 막 네트워크 분석 세포 내 칼슘 이미징 패치 – 클램프 전기 생리학 또는 약리학 용량 – 반응 연구 등 일반적으로 사용되는 세포 생물학 기법 수가 심방 또는 심실로부터 고품질 프라이 머리 셀 분리에 매우 의존 또는 선택 심장 조직의 일부는 성숙 구조적으로 차별화 된 생리 그대로 심장 근육 세포의 특성을 활성화합니다. 따라서, 제 1 절에 설명 된 AM 및 VM 세포의 분리 및 품질 평가는 그대로 막과 세포의 무결성에 달려있다 여기에 설명 TATS 네트워크 분석, 등 다양한 질문에 대한 궁극적으로 유용하다. 그림 1은 심장 조직의 박리가 마우스 심장의 심방 챔버로 시작하는 진행하는 방법을 이미지의 단계별 가이드를 제공합니다. 이어서, 심실 중격 챔버와 대비할필요에 따라 해부 거라고. 정확하고 올바른 선택 티슈 부품의 제조를 확실하게 충분한 세포 순도 AM 및 VM 아이솔레이션을 설정하는 것이 중요하다. 콜라게나 제 소화 다음 그것은 심방과 심실 조직 사이의 박리의 정확한 라인을 식별하기 위해 상대적으로 어려울 수있다, 그러나 AM 및 VM 세포가 세포 현탁액의 제어되지 않은 혼합되면, 혼합 된 세포 집단을 반전하는 것은 불가능하다. 따라서, 해부학 방향은 3 차원 시각화 조직, 소화 된 조직 운반 충분한 경험은 특정 조직의 부품, 그들의 절개 라인의 정확한 식별은 모든 세포 격리의 성공에 기여할 것이다. 심방 조직의 그림 1.Dissection. (A) 심장의 앞쪽 부분을 직면,이 수술의utures는 21 G 스틸 캐 뉼러의 그루터기 끝 근위 대동맥을 고정합니다. 해부하는 동안 심방 실보기를 방해하는 폐 조직을 남아있는 마음으로 쇼를 향해 (B)보기. LA, 중앙 홀 왼쪽; RA, 우심방. (C) 남은 lungtissue 및 대 혈관은 심방 실에 액세스하기 위해 제거되었습니다. 검은 색 삼각형, 폐동맥을 가득; 가로 무늬 삼각형, 폐 혈관; 흰색 삼각형, 상부 대정맥을 가득; 박스 삼각형, 아래 대정맥. (D) 집게 심방 부속기를 누르고있는 동안 첫째, 우심방 벽 해부한다. (E) 오른쪽 심방 실 공동으로보기. 검은 색 삼각형은 그대로 심방 중격을 표시합니다. (F) 해부 왼쪽 심방 실 캐비티를 입력 계속됩니다. (G) 왼쪽과 오른쪽 심방의 완전 박리 후, 방실 밸브가 표시됩니다. 섬유 밸브 장치는 해부와 subseq하는 폐기uently 만 심실 근육 조직을 수확. 격리 좌우 심방의 (H) 후방보기를. LA, 중앙 홀 왼쪽; RA 오른쪽 atrium.Scale 바 : 700 μm의. 세포 아이솔레이션의 품질을 확인하기 위해 그림 2는 AMS 및 VM을 모두 수율 및 일반적인로드 또는 가로 무늬 그대로 근육 세포 모양의 벽돌의 생존 능력을 평가하는 동안 일반적인 세포 예제를 제공합니다. 작은 쉽게 섹션 1.11에 설명 된대로 트리 판 블루 배제를 포함하여 식별 할 수 있습니다, 비정상적인 과도 곡선 형태학, 또는 이상이 구형 모양의 세포를 시각적으로 눈에 띄지뿐만 아니라 심각하게 손상된 세포를 손상. 트리 판 블루 세포에 노출되었을 때 손상 근세포 밝고 균일 줄이있는 남아 있지만, 손상된 세포는 일반적으로 다중 막 기흉 표시 및 / 또는 신속 트리 판 블루 세포 내 나타내는 멤브레인의 손상을 축적. 그러나, 그 자체로 트리 판 블루 unnecessari를 통해 세포에 손상을 줄 수 있습니다LY 긴 인큐베이션하고 즉각적인 셀 품질 산정 따라서 필수적이다. myofilament 구축 또는 중대한 표면 손상 손상 세포의 무결성과 같은 세포 손상의 더 확실한 형태의 예는도 4C와 4D에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 도 2 트리 판 블루 배제 세포 염색. 격리 (A)는 AM 및 (B) VM 세포는 트리 판 블루로 현탁액에 혼합 40Xmagnification에 도시 된 반전 된 광학 현미경에 의해 가시화된다. 트리 판 블루 leaka indicatesmembrane을 차지 thatabnormal 구면 (A)에서의 세포 및 (B)를 참고GE의 구조적 손상. 도시 된 바와 같이 반대로, 양막 centralAM 및 VM 세포는 트리 판 블루 배제. 또한, 그 손상 AM를 기록하고 VM 세포는 세포 부피에 걸쳐 근절의 줄무늬, nomembrane의 기흉, 그리고 양측의 날카로운 모서리 모두 인터 디스크를 보여줍니다. 스케일 바 : 20 μm의. 10 6 5 × 10 5에서 VM을 성공적으로 분리, 세포 수율을 다음은 한 번의 마우스 심장 소화에서 예상 될 수있다. AMS의 수율은 3 × 10 3 4 10 × 3 봉상, 트리 판 블루 제외 세포의 순서로 상당히 낮다. VM 대조적으로, 아이솔레이션 가끔 심지어 경험이 풍부한 손에 실패하고있다. 단계 1.11 방법 서스펜션에서 격리 된 건강한 세포의 수율을 추정하는 절차를 요약 한 것입니다. 개별 AM 또는 VM 세포 분리를위한도 3에 도시 된 바와 같이 부가 적으로, 단계 내지 1.13의 평균 셀 크기를 결정 또는 VM의 세포 집단 대를 나란히 (필요에 따라)를 AM을 비교. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 심장 근육 세포의 3.Bright 필드 형태 계측 학적 분석을줍니다. VM 윤곽 단계 1.13에서 설명 된 이미지 분석 도구를 사용하여 검출되었다. 표시를 시각적으로 분석 외면 막에 의해 정의 된 셀 외 경계를 정의하는 다각형 선택 도구를 사용한다. 광고 투자 수익 (ROI) 관리자의 관심 (ROI)의 선택 영역은 1 차원 거리 측정 하였다. 종횡비 : VM 치수 대 AM의 비교 연구를 들어, 셀의 길이, 폭 및 영역을 기록하고, 길이를 계산하는 것이 유용하다. 도 4a에 도시 TATS 네트워크의 대표 이미지 결과와 공 초점 현미경, 이어 부 (2)에서 설명한 바와 같이 AM 또는 VM 셀 중 형광 염색 TATS 막으로 NT ">, 적분 막 염료 디-8-ANEPPS 사용된다 도 4b. 또,도 4a는 그대로 AM 나란히 촛점 TATS 이미지와의 대응 투과광 쇼 이미지 (화상 취득 부 (3) 참조). 스텝 1.12, 삶의 형태 및 표면 막 무결성에 의해 설명 된 바와 같이 건강의 VM 근세포가 투과광 이미지를 판정한다. 디-8-ANEPPS 신호의 확대 된 영역이 풍부 축 (종 방향) 막 세뇨관 특징 AMS에서 TATS 네트워크의 기본 형태를 강조한다. 반대로 TATS 모폴로지 도 4b에 도시 된 바와 같이 축 방향의 대략 비슷한 숫자 특징D 가로 구성 요소. 대조적으로, 추가 분석에서 제외해야 손상된 심장 근육 세포의 4C와 4D 예를 보여 피규어. 1.2 μM의 비정상적 짧은 근절 길이 및도 4d에서 VM 셀 다중 막 기흉을 나타내는 반면 불규칙한 왜곡 TATS 네트워크에 의해 입증되는 바와 같이 특히,도 4c에 AM 셀이 수축 멤브레인 중단을 나타내는 (일부는 붉은 삼각형 의해 강조) , 외부 표면 막에서뿐만 아니라 TATS 막에서 발생할 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그대로 심방과 심실 미오의 그림 4.Live 막 염색cytes가. 빛과 생활의 공 초점 이미지 전송 해당 디 – 8 – ANEPPS 그대로 (A)를 스테인드 오전 (B) VM 세포. 대조적으로, 1.2 μM의 근절 길이 부분적으로 수축하고 잠재적 손상은 AM (C)에 도시된다. 계약 근육 세포는 일반적으로 비정상적으로 단축 쇼와 왜곡 TATS 구조는 따라서 추가 분석에서 제외. 세포막에 대한 또 다른 중요한 결점 표시기에 VM (D)에 나타낸 바와 같이 막 기흉 (적색 삼각형)이다. 막 기흉은 기흉으로 손상된 표면 막 구조와 세포는 더 TATS 분석에서 제외해야 나타냅니다. 또한, VM 분명히 (별표로 표시)의 왼쪽 아래 부분의 전체 부분을 놓치고 심한 손상을 보여줍니다. 요약하면, 투과광 및 공 촛점 이미지를 비교함으로써, 세포의 형태 및 표면 intactness 문서화 및 형광 신호 정보와 결합된다. 'N'마크 뉴CLEI은 TATS 막 얼룩 분석에서 생략. 노란색 막대는 위에서 제시 한 동일한 공 초점 이미지에서의 ROI를 확대 표시합니다. 스케일 바 :. 10 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 도 4a 및도 4b에 나타낸 바와 같이 충분한 신호 대 잡음비와 TATS 막의 공 촛점 이미지는 상기 정량 분석을 위해 허용된다. TATS 막 분석은 형광 직선 신호 성분들로부터 유도 골격 화 된 데이터에 기초한다. 5 4.3-4.5 공정에 의해 상세히 설명한다 개별 화상 처리 단계의 흐름 다이어그램을 보여준다. 이 단계는 각 격리 된 VM (그림 5A)에 대한 그림과 같이 직선 TATS에게 막 네트워크를 대표하는 골격 화 이미지를 생성 및 인터넷 (세포 AMgure 5B). TATS 네트워크의 골격 화 화상 이어질도 5.Workflow 형광 TATS 화상의 골격 화 대. 이미지 처리 단계는 각각의 단계별 이미지의 예에 의해 양쪽 디-8-ANEPPS 대한 표현은 VM (A) 및 AM 스테인드 (B). 개별 이미지 처리 단계를 들어, 4 절을 참조하십시오. 스케일 바의 차이에 유의하십시오. 20μm (A) 및 10μM (B)를 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 4.5 절에 설명 된대로 이미지 처리 중 중요한 단계는 데이터 이진화에 대한 적절한 임계 값을 결정합니다.6. 결과 바이너리 이미지 만 TATS 네트워크에서 참 막 신호가 아닌 배경 신호 잡음에서 오류 임계 값에 의해 파생 된 잘못된 구조를 포함해야한다. 그러나, 상기 임계 값에 해당 TATS 성분 오 이미지 분석 중에 손실되지 않도록 모두 해당 TATS 구조를 검출하기에 충분히 낮은 것이 중요하다. 6은 어떻게 데이터 치화 동안 임계 값을 선택하는 과정을 도시 한 도표. (40)의 임계 값은도 6b에 도시되고도 6c는 노란색 삼각형으로 표시된 바와 같이 희미 축선 막 구조물 (ATS)를 감지하지 못하는도 6a에 도시 된 바와 같이 (60), 더 높은 임계 값 등을 선택, 개별적 전부 사실 TATS 구조를 감지하는 적절한 보인다 반면 . 로 나타낸 바와 같이도 6D에 나타낸 바와 같이 반대로, (20)의 낮은 임계 값을 선택하는 예는 배경 잡음으로서 위양성 TATS 구조의 오 검출에 이르게노란색 삼각형. 그림 6.How는 TATS 이미지 데이터의 skeletonizing 동안 신호 임계 값을 결정합니다. 예제는 각각 (4.5 단계에 설명 된) 데이터 이진화 동안 서로 다른 임계 값에 대해 생성 TATS 해골을 보여줍니다. 상부 이미지 : 피지를 사용 임계치 조정을 나타낸다. 하부 이미지 : 해당 입력 형광 이미지와 골격 화 화상과 확대 된 영역의 중첩 표시된. 높은 임계 예에 적용된 60 (A)의 확대 된 부분에 노란색으로 나타낸 바와 같이 삼각형에 모두 해당 TATS 구조를 감지 명백하게 적합하지 않다. (B) 및 (C)에인가 (40)의 임계 값은 낮은 임계 예 반면, 배경 잡음을 정확하게 감지하지 못하는 모든 TATS 구조를 감지., 20 (D)는 잘못 존재하지 않는 막 구조물의 위양성 신호를 생성함으로써 TATS 구조로서 배경 잡음을 식별하고. 거짓 – 긍정적 인 신호가 확대 삽입 노란색 삼각형으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 는 "해골 (2D / 3D)를 분석"플러그인은 골격 화 TATS 구조의 상세한 분석을 지원합니다. #branches, #junctions, # 엔드 포인트 복셀 평균 분기 길이, #triple 점, #quadruple 포인트 및 최대 분기 길이 : 일단 플러그인은 다음과 같은 골격 매개 변수를 사용하여 데이터 테이블을 생성, 실행. 가능한 모든 출력 매개 변수에 대한 자세한 설명은 tohttp 참조하십시오 //fiji.sc/wiki/index.php/AnalyzeSkeleton 및 관련 기사 29 ~ 31. 전형적인 데이터 테이블의 출력은도 7a에 도시된다. <p클래스 = "jove_content"> 파라미터는 상기 면적당 전체 골격 길이 또는 면적 당 접합 수를 유도하기 위해 사용될 수있다. 분기 평균 길이를 곱한 분기의 수의 예시적인 계산은 2 차원 연속 골격의 전체 길이를 제공한다 : 투자 수익 (ROI) 당 총 골격 길이 : Σ (#branches의 X 평균 분기 길이) = 5155 PX = 515.5 μm의 골격의 길이는 전체 이미지 영역에 정규화 될 수있다. 아래와 같이도 7 0.64μm의 정규화 골격 길이에 나타낸 예를 들어 / 2 μm의 모든 접합부의 합은 계산된다 : 표준화 된 골격 길이 : 515.5 μm의 / 803.6 μm의 2 = 0.64 μm의 / μm의 2 접합의 정규화 번호 : 155 접합 / 803.6 μm의 2 </SUP> = 0.19 접합 / μm의 2 골격 화 이미지에서 7.Automated 데이터 출력 그림. (A) (B)에 나타내는 골격 화 화상으로부터 '뼈대 분석 (2 차원 / 3 차원)'에 의해 생성 된 플러그 일반적인 데이터 스프레드. 가능한 출력 매개 변수에 대한 자세한 설명을 참조하시기 바랍니다 http://fiji.sc/wiki/index.php/AnalyzeSkeleton . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 도 5에 4.5에 설명되고 예시 화상 처리 단계는 부가 코드 파일로서 제공 피지 매크로를 사용하여 자동화 될 수있다 </str> 옹. 명령은 반복적 인 단계를 통해 이미지 처리의 반복을 정의합니다. 매크로는 단계 4.3 및 4.4를 통해 제조 입력 영상의 스택을 완성하기 위해 적용될 수있다. 매크로 매크로 명령을 이용하여 자동화 된 분석을 위해 각각의 독립적 인 처리 군에 대한 개별 입력 화상 스택을 제조함으로써, 예를 들면, 완전한 데이터 세트 그룹의 분석을 위해 유리할 수있다. 설명 소프트웨어 전략은 더 모든 구성 요소에 대한 TATS 네트워크 방향 분석을 할 수 있습니다. 이를 위해, 히스토그램 데이터의 모든 구성 요소 TATS 배향 방향 분포를 나타내는 생성 "방향성"플러그인 (http://fiji.sc/Directionality) 29,31 사용. 입력 화상의 x 축이 소정 AM 또는 VM 셀의 주축에 해당하면 횡단 요소가 90으로 표시되는 반면, 축이 (종 방향) TATS 성분은, 0 ° 빈에 의해 표현 될# 176; 빈은. 8 일 실시 방향성 AM (8B) 세포에 비해 VM (8A)에 대한 골격 화 TATS 이미지에서 히스토그램을 보여줍니다. 일반적인 VM의 방향성 히스토그램은 0 °와 90 °에서 더블 피크 분포를 나타낸 반면, AM 히스토그램은 0 °에서 하나의 지배적 인 피크를 보여줍니다. 이러한 예는 AMS의 TATS 구성 요소는 주로 A-세관 구성 될 수있다 반면 VM을 개별 TATS 구성 요소가 거의 동일하게, T-세관 및 A-세관에 분산되어 이전의 관측과 일치한다. 개별 셀의 TATS 네트워크에서 8.Representative 방향성 히스토그램을 그림. 방향성 히스토그램은 오전에 비해 개별 VM (A)의 골격 화 이미지에서 생성 된 (B를 </강한>) TATS 네트워크. T-세뇨관 성분은 90 ° 빈에 의해 표현되는 반면, 분석 된 이미지의 X 축이 나타내는 바와 같이 심근의 주 (세로) 축에 대응하는 것을 감안할 때, A-세뇨관 성분은, 0 ° 빈에 의해 표현된다. 가우스는 배경 그래프로 주요 히스토그램 peakasshown에 적합합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 관류 버퍼 mM의 염화나트륨 120.4 의 KCl 14.7 KH 2 PO 4 0.6 나 2 HPO 4 0.6 황산 1.2 HEPES 10 탄산 수소 나트륨 4.6 타우린 30 2,3 – 부탄 – monoxime 10 포도당 5.5 pH를 7.4 소화 버퍼 MM은 (지정되지 않은 경우) 염화나트륨 120.4 의 KCl 14.7 KH 2 PO 4 0.6 나 2 HPO 4 0.6 황산 1.2 HEPES 10 탄산 수소 나트륨 4.6 타우린 30 2,3 – 부탄 – monoxime 10 포도당 5.5 콜라겐 유형 II 600 U / ㎖ pH를 7.4 스톱 버퍼 MM은 (지정되지 않은 경우) 염화나트륨 120.4 의 KCl 14.7 KH 2 PO 4 0.6 나 2 HPO 4 0.6 황산 1.2 HEPES 10 탄산 수소 나트륨 4.6 타우린 30 2,3 – 부탄 – monoxime 10 포도당 5.5 염화칼슘이 0.0125 소 혈청 10 % pH를 7.4 표 1.Buffer의 오디오 솔루션이온. 세포 격리 및 이미징을위한 세 가지 생리 학적 완충액의 함유량이 요약되어있다.

Discussion

심장 근세포 절연 및 32 년간 연구되어 왔지만, 최근의 리뷰가 일관된 고품질 근세포 절연 부 (27)가 도전 남아 있다고 결론 지었다. 이것은 힘? 힘 공통 표준 접근의 부족, 공유 메타 데이터 및 투명 세포 품질의 문서 기본 심장 근육 세포의 분리를위한 상대적으로 복잡한 프로토콜을 반영한다. 세포 격리 프로토콜은 일반적으로 개별 그룹에 의해 정의되고, 세포 분리의 변수 결과를 생산 개별 모델 설정 (예를 들어, 종, 연령, 공존 심장 조건)에 따라, 일반적으로 특정 실험 조건에 대한 조정됩니다. 멤브레인 연구 및 프로토콜이 여기에 제시된 정량적 TATS, 품질 평가 및 문서의 필수 레벨의 컨텍스트 내에서 대사 및 분리 프로토콜에 따라 변화하는 경향이 개별 세포막 구조 또는 공 초점 현미경에 관한 수퍼 해상도 모두AM 또는 VM에서. 중요한 것은, 세포 분리의 높은 수익률이 건강한 그대로 근육 세포를 제안하더라도, 연구자들은 문서화하고 비판적으로 인한 다른 유형에 특정 변경 대 격리 절차의 비 특정 손상에 비해 표면과 TATS 막 무결성의 형태 학적 기준에 따라 신중하게 각각의 셀을 판단 할 필요가 중재의 같은 조건을 제어하는​​ 비교. 심장 세포 격리 중 중요한 변수는 소정의 콜라게나 많은 특정 활동이다. 콜라겐의 새로운 많이 선택하려면 몇 가지 콜라겐 시료의 효소 활성은 심장 근육 세포 수율과 품질을 평가하고, 제조사의 지시에 따라 서로에 대해 테스트해야합니다. 이상적으로, 콜라겐의 새로운 많은이 이전 성공적으로 사용을 많이 유사한 콜라게나 제 활성을 식별된다 (가능한 효소 활동의 확장 된 평가 대상 및 방법 테이블에서 "콜라게나 많은 선택 도구"참조). T함께 AKEN, TATS 막 시각화의 정량적 접근 방법은 세포 격리 품질과, 그 반대의 분리 절차의 중요한 검토 및 수정을 트리거해야 TATS 현미경으로 설명 된대로 불특정 막 손상으로 이어지는 심장 세포 절연 부에 결정적으로 의존한다. 세포 격리 품질과 TATS 막 시각화 및 정량화가 본질적으로 연결되어 있기 때문에,이 문서에서 설명하는 프로토콜은 연속적인 전략으로 모든 주요 측면을 커버합니다.

추가 과제 및 심장 연구, 세포 손상 및 / 또는 세포 손실 일반적인 문제는 심근 경색 9 다음 대사 저해 개입 등으로 인하여 발생할 아직 세포 격리 중 주목 공기 색전증 다음, 전위 부주의 한 파손 등 대해 판단 할 필요가있다. 병든 마음에서 심장 근육 세포의 분리는 추가로 상당한 세포 손실로 이어질 세포 수율을 감소 할 수 있습니다. 따라서, 비교 예세포 격리 및 카운팅 일관 표준화 된 프로토콜을 통해인가되는 경우 제어 및 심장 질병 간의 절연 손상 세포의 총수의 ISON은 의미가있을 수있다. 결과적으로, 최상의 심근 세포 격리 품질을 반영 적절한 대조군을 통해 셀의 무결성을 판단하는 것이 중요하다. 중요한 것은 각각의 셀의 품질과 비교 근세포 또는 질병 건강의 생균 현미경 부주의 크게 TATS 막 네트워크의 분석에 영향을 미칠 수있는 분리 절차에 의해 손상. 여기에 제시된 프로토콜에 따라서 세포 격리 및 양막의 생균 생리 현미경 중에 막 요소의 무결성과 안정성을 강조한다. 전체 흐름은 이러한, membran 파쇄 막 세뇨관 같은 분리 멤브레인 종속 아티팩트를 나타낼 것이기 때문에, 달성하고 손상된 세포를 제외한 상태 그대로 TATS 세포막 성분을 보존하기 위해 연속적으로 설계 전략전자 기흉 및 변경된 TATS 네트워크 잘못 양적 분석 제어 조건에서 타협. 부사장은 반대, 같은 전략은 TATS 막 변경 사실 병에 걸린 세포에 비해 진정한 건강 사이의 의미있는 비교 컨트롤에 결정적으로 의존 TATS 멤브레인을 방해 할 가능성이있는 중재 연구에 중요하다.

또, AM 세포의 기술적 훨씬 더 도전 격리를 달성하는 절차를 다룬다. 진보 및 개선 된 프로토콜에도 불구하고, 그것의 VM 고품질 셀 아이솔레이션을 재현 사소한 심지어 덜 신뢰할 AMS 대없는 것을 강조하는 것이 중요하다. 이것은 VM 세포 손상의 순한 정도 인해 상대적으로 높은 세포에 세포 현탁액 덜 명백 할 수도있는 반면, 세포 격리 중에도 작은 오차 또는 변형이 AM 세포 분리의 완전한 고장으로 이어질 수 AM 세포의 전반적인 낮은 수율로 인해 숫자는 오전에 비해. AM 셀 C가 될 수 있으므로단계 4.3에서 설명 된대로 분리 한 후 urved 여러 ROI를 통해 분석이 유용 할 수 있습니다. 세포 격리 단계의 세부 절차에 따라, 우리는 직접 세포막 염색 및 공 초점 또는 VM 및 AMS 모두 TATS 네트워크의 STED 수퍼 해상도의 영상을위한 프로토콜을 제공합니다. 이러한 프로토콜은 이전에 설정된 매개 변수를 통해 양적 분석과 TATS 세포막의 구성 요소 선택의 차별화를 할 수 있습니다. VM에 비해, 3 차원 조직 및 AMS의 심방 TATS 네트워크의 기능적 동작은 현재 덜 이해된다.

살아있는 세포에서 이미지 TATS 막에 대한 절차는 (3.7 3.1 단계) 상업 공 초점 (자재 / 장비의 표)와 맞춤 STED 형광 현미경 9로 개발되었다. 형광 화상 생성 TATS 및 정량 분석​​을위한 현미경 설정을 최적화하기 위해, 다음과 같은 점은 일반적으로 중요하다 :

  • 목표 </str옹>
    경험적으로, TATS 막 구조의 세부 사항을 해결 작은 셀 깊은 몇 마이크로 미터를 포커싱하는 동안 높은 이미지 품질을 제공하는 객관적인 테스트하기 위해. 특정 공 초점 현미경 여기에 사용 63X 1.4 NA 오일 목적 대조적으로, 물이나 글리세롤 목표에 더 잘 수행 할 수있다. 100X 배율의 목표는 나노 미터 해상도 34에 작은 시야각을 거래, 수퍼 해상도 STED 현미경에 사용됩니다.
  • 여기 및 이득
    여기 전력 검출기 이득의 최적 설정은 현미경 광로 레이저 성능 및 샘플 특성에 의존한다. 이상적으로는, 레이저 출력과 이득은 검출기의 전체 범위를 활용하면서도 화상 포화를 피하기 위해 조정된다. 현미경 상용 소프트웨어 패키지는 일반적으로 동적 범위의 하한 및 상한을 시각화 룩업 테이블을 제공한다. 또한, 염료 표백 최저 리터를 사용 최소화아직 충분한 구조 TATS 막 세부 사항을 제공 aser 전원. 또한, 구동 전력은 심근 경축 및 죽음에 이르는 누적 사진 손상을 방지하도록 충분히 낮아야한다.
  • 픽셀 크기
    나이 퀴 스트 (Nyquist) 샘플링과 호환되는 픽셀 크기, 주어진 설정으로 달성 절반 정도의 해상도를 사용합니다. 촛점 촬상 100 nm의 X 100nm의 픽셀 크기는 표백 제한되는, 호환된다. 수퍼 해상도 현미경은 상당히 작은 픽셀 크기는 STED 현미경 9 예를 들어, 20 나노 미터 × 20 nm의 사용됩니다.
  • 전환 시간
    공 초점 현미경 평균화 기능을 제공한다. 일반적으로, 신호 평균화 예와 조합 표백 않도록 최단 화소 체류 시간을 사용하여, 라인 평균 ≥ 8은 신호 – 대 – 잡음 비율을 향상시키기 위해.
  • 메타 데이터를 통해 응용 현미경 설정을 문서화
    에 어떻게 설정되면TATS 막 구조의 이미지 세부 사항은 특정 공 초점 현미경에 안전 최적화 및 / 또는 설정 (프로토콜 메타 데이터)를 문서화 하였다. 같은 목적, 여기 전력, 이득, 픽셀 크기, 픽셀 체류 시간, 평균 기능 세포의 (또는 사이) 그룹 (들) 내의 모든 이미지를 획득. 평등 이미징 조건은 세포의 (또는과) 그룹 (들) 내에서 직접 비교하고 정량 할 수 있습니다.
  • 일반적인 지침과 원칙 및 공 초점 현미경의 응용 프로그램에 대한 자세한 사항은 생물 공 초점 현미경 (Pawley JB, 제 3 판, 2006, 스프링 과학 + 비즈니스 미디어, LLC)의 핸드북을 참조하십시오.

여기에 제시된 직접 분석 전략, TATS 막과 질병 관련 변경 사항을 설명하는 이전의 출판물과는 달리 푸리에 TRANSF에 따라 양적 전략 16, 17, 또는 간접적으로 지역 전략으로 T-세관 밀도의 지역 집계 판독을 사용했다T-세뇨관 성분 7 규칙 성을 평가하기 위해, 선 형상의 막 신호 ormation 분석. 대조적으로, 여기에서 설명하는 양적 접근 방식은 직접 개별 TATS의 구성 요소와 관련된 멤브레인 네트워크 특성과​​ A-세관의 비율과 같은 특정 구성 요소를 포함하여 추가 매개 변수를 제공한다. 또한, TATS 네트워크 밀도는 ROI 면적당 전체 추출 골격의 길이로 정규화 정량화 될 수있다. 세 개인의 삼중 접합의 개수는 연속적으로 연결된 세뇨관 성분은 TATS 막 네트워크 분파 복잡도의 측정치로서 사용될 수있다. 우리는 작은 TATS 구성 요소의 분석은 염색 절차에 따라 있습니다. 우리의 경험에 의하면, 50 μM 디 – 8 – ANEPPS 용액 800 μL은 50,000 VM 세포 구를 포함하는 세포 펠렛에 완료 TATS 네트워크를 염색하기에 충분하다. 그러나, 세포 펠렛은 심장 근육 세포의 낮은 숫자가 포함 된 경우강력한 형광 검출기를 사용할 수 있으며, 경우에 작은 막 자세한 내용 및 양적 변화가 관심있는 것이 아니라 전체 TATS 네트워크 분포의 공 초점 이미징, 낮은 염료 농도는 실제 테스트를 기반으로 사용할 수있다합니다. 마지막으로, 설명 된 분석 용으로 작성된 소프트웨어 매크로 다른 처리 군 (예를 들면, 약물), 세포 유형 간의 비교를 위해 특히 유용하다 더 큰 데이터 세트의 분석을 용이하게하는 화상 처리 단계를 자동화하는데 사용될 수있다 (예를 들면, VM 대 AM ) 및 병태 생리 학적 개입 (예를 들어, 심근 경색 대 가짜).

TATS 네트워크의 화상 분석을 위해, 원칙적으로 다음과 같은 일련의 단계가 적용된다 : 1) 압연 공 배경 차감 (4.5.1)이 배경 강도의 공간적 변화를 제거하는 단계; 2) 지역 대비 향상 (4.5.2).; 3) 이미지 다듬기 (4.5.3); 4) 통계 영역 병합 (4.5.4); 5) 정의이미지 이진화의 임계 값 (4.5.6); 골격 데이터 및 6) 계산 (4.5.8). 형광 TATS 화상의 골격 화 동안 중요한 단계는도 6에 도시 된 이미지 이진화이다. 연관된 임계 단계 궁극적 진정한 막 구조가 배경 잡음에서 에러로 식별 잠재적으로 잘못된 구조 대 기초 TATS 성분을 나타내는 검출 된 정의한다. 바이너리 이미지 분석을위한 정확한 임계 값의 식별은 공 초점 현미경 및 수퍼 해상도 접근법위한 충분히 높은 신호 – 대 – 잡음 (SNR)에 따라 각 비율에 해당 TATS 막 구조와 일치한다. 따라서, 충분한 화상 품질이 제 명시된이어서 시야 화상에 의해 문서를 포함 개별 셀의 품질 판단의 임계 결합이 확립되어야한다. 다른 옵션은 주어진 현미경 데이터 출력 및 / 또는 PHY들에 대한 이미지 분할 프로토콜 적응학적 질문 이미지 디컨 볼 루션과 ImageJ에 플러그인으로 사용할 수 "오츠"또는 "이소 데이터"와 같은 다른 임계 절차를 포함한다. 관계없이 최종 분할 절차, 우리는 이미지 오버레이 의해 추출 된 원시 데이터 간의 비교 필수 품질 관리 단계를 고려한다. 요약하면, 각각의 절연 근세포, 세포 TATS 막의 충분한 염색, 형광 촬상 용 파라미터 최적화, 추출 골격 데이터의 오버레이 제어의 형태와 막 무결성 모두 형광 TATS 이미지 및 정량 결과의 품질에 기여한다.

마우스보다 큰 종 세포 분리에 사용하는 경우, 프로토콜은 용이하게 적절히 적용될 수있다. 다음으로 큰 종이를 들어, 쥐의 마음이 무딘 14 G 정맥 (외경 2.1 mm)와 유관 할 수 / 분 8 ML에서 관류. 크게 세 또는 질병 마음 더 큰 정맥의 크기를 필요로 할 수있다. 유전자에RAL 심장 관류는 저장조 및 대동맥 사이 또는 연동 펌프를 사용함으로써 일정한 흐름 1m 높은 물 컬럼을 사용하여, 일정한 압력에 의해, 예를 들면 어느 수행 될 수있다. 콜라게나 소화는 결국 일정한 흐름 프로토콜에 의해 어느 정도 제어됩니다 누출 용기 침대에서 과도한 관류 속도로 최고의 관상 동맥 저항 혈관을 방해하기 때문에 쥐와 쥐 같은 작은 설치류 마음에서 세포 격리를 들어 일정한 흐름이 유리할 수있다. 유량 및 정확한 삽관의 모니터링이 변경된 혈관상 저항 행동 중재 모델뿐만 아니라 세포 격리 절차 훈련 유리하다 우선,하면 반대로 정압 관류 유리하다.

위에서 설명한 바와 같이, 충분한 셀 품질이 내생 멤브레인 시스템의 정량적 연구에 매우 중요합니다. 그러나, 심장 관류 및 콜라게나 소화하는 동안 수많은 요인 CR 수 있습니다itically는 프로토콜 최적화 또는 문제 27 촬영 중 과소 평가해서는 안 세포 격리의 품질에 영향을 미칩니다. 특히, 주어진 콜라게나 로트의 활성 연구의 나머지 부분에 걸쳐 유지 될 관심 예 : 심방 또는 분리 조건을 설정하는 실험 선의 연구의 실행에 앞서 심실의 특정 조직에 대해 결정되어야한다. 또한, 관류 설정의 수질, 산도, 온도, 최적화 및 청소 오염물 및 색전에서 부주의 한 손상의 위험을 최소화하고, 잠재적으로 추가적인 요인은 세포 격리 중에 최적의 항상성의 조건을 확립하기 위해 모니터링되어야한다. BDM (2,3 – 부탄 – monoxime) 마이 오신 ATPase의 크로스 다리의 가역적 억제제는 일반적으로 세포 아이솔레이션의 수율을 증가 심장 근육 이완을 유지하기 위해 조직의 절개 및 소화 중에 사용됩니다. 그럼에도 불구하고, 연구자들은 t 필요오 BDM 오프 대상 효과 예를 들어, 특정 조건 33에서 나 + / 칼슘 교류 전류의 억제로 이어지는 비 특정 포스 파타 아제의 활동을 행사할 수도 있다는 점을 유의해야합니다. 일부의 실험은 독성이 비교적 고가 심정지 솔루션, 그러나,이다 마이크로 몰 농도의 마이 오신에 대한 높은 선호도 억제제로 blebbistatin에 의해 BDM을 대체하는 것이 유리할 수 있습니다 및 기타 오프 대상 영향을 미칠 수 있습니다. 휴식 건강한 심근 추가 분석에서 제외해야 전기 자극하고 세포의 부재에있는 수축을 보여주지해야한다. 한편, 생체 외 칼슘 농도에서 전기 자극에 응답하여 심장 근육 세포의 수축과 이완에 건강 관리 대 심장병 기능성 셀의 품질 및 / 또는 비정상적인 행동을 평가하기 위해 추가적인 수단으로 정상적인 수축 거동을 확립하는데 사용될 수있다 세포.

<p class="요약" "jove_content는">, 단일 세포 분리 및 여기서 설명 정량적 화상 분석을위한 프로토콜이 성공적으로 셀 (21)뿐만 아니라 용의 미세 소관 네트워크의 정량 분석을 VM 9 TATS 막 네트워크의 촛점 및 수퍼 해상도 현미경 적용 및 AM되었습니다 고정 심장 근세포 (데이터 미도시). 이러한 서로 다른 발달 단계에서 TATS 멤브레인의 특성 또는 TATS 네트워크를 문의 막 관련 단백질 또는 세포 내 소기관 구조의 분석과 같은 실험 다양한 질문에 대한 길을 열 수있는 프로토콜이와 미래의 응용 프로그램은 매우, 도메인 특정 신호 지역화 발휘 AM 및 VM 세포의 기능을한다.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work received support through Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 1002 (subprojects A05 and B05 to S.E.L.) and KFO 155 (subproject 4 to S.E.L.), a Halbach Foundation award to S.E.L. supporting E.W.; a grant from the German Cardiac Society to S.B.; and a DAAD exchange program supporting T.K. as visitor at the University of Maryland. The research leading to these results has received funding from the European Community’s Seventh Framework Program FP7/2007-2013 under grant agreement No. HEALTH-F2-2009-241526, EUTrigTreat (to S.E.L.). S.E.L. is a principal investigator of the German Center of Cardiovascular Research (DZHK).

Materials

Chemicals and enzymes
2,3-Butanedione monoxime Sigma-Aldrich, Munich, Germany B0753
Bovine calf serum Thermo Scientific, Schwerte, Germany SH30073 Triple 0.1 µm sterile filtered.
CaCl2 Sigma-Aldrich, Munich, Germany 21115 Diluted 1:10 in MQ water to obtain 100 mM CaCl2 stock concentration.
Collagenase type II Worthington via Cell Systems, Troisdorf, Germany on request Enzymatic activity depends on individual collagenase batches. Collagenase II  and other enzyme activities (Caseinase, Clostripain, Tryptic) can be assessed in the "collagenase lot selection tool". Determine cell yield and quality individually for each new lot of collagenase.
Glucose Carl Roth, Karlsruhe, Germany HN06.1
Heparin Rotexmedica, Trittau, Germany PZN-03862340 Diluted in 0,9 % NaCl and injected subcutaneuosly in abdominal skin.
HEPES Carl Roth, Karlsruhe, Germany 9105.4
Forene 100% (V/V) Abbott, Libertyville, IL, USA B506 Active agent: isoflurane, 250 ml. Use approximately 2 Vol% in air/oxygen dispenser instrument.
KCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 6781.3
KH2PO4 Carl Roth, Karlsruhe, Germany 3904.2
Laminin (2 mg/ml) BD Biosciences, Heidelberg, Germany 354232 Lamination is described under step 2.1.
MgCl2 · 6 H2O Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2189.2
MgSO4 · 7 H2O Carl Roth, Karlsruhe, Germany 8283.2
Na2HPO4 · 2 H2O Carl Roth, Karlsruhe, Germany 4984.2
NaHCO3 Carl Roth, Karlsruhe, Germany HN01.1
Taurin Carl Roth, Karlsruhe, Germany 4721.2
Dyes
Di-8-ANEPPS Molecular Probes, Life Technologies, Darmstadt, Germany D-3167 Stock solution 2 mM in DMSO
Trypan blue Sigma-Aldrich, Munich, Germany T8154 Trypan blue is gently mixed 1:1 via tip-cut 1 ml plastic pipette with cell suspension prior to cell counting in Neubauer cytometer.
Langendorff perfusion setup
Circulation thermostat Lauda, Lauda-Königshofen, Germany Please refer to Louch et al. (JMCC 2011). Heat up thermostat und buffers in perfusion tubing to 37 °C 15 min prior to use.
Flexible silicone tubing Tygon for peristaltic pump VWR, Darmstadt, Germany 224-2252 Tubing needs to be changed regularly.
Flexible silicone tubing Tygon for thermostat VWR, Darmstadt, Germany 228-4340
Heating coil surroundung perfusion tubing Rettberg, Göttingen, Germany custom-made Heating coil and tubing needs to be cleaned thoroughly via MQ water after using. Do not use detergents. Glass components should be bathed regularly  in 10 mM NaOH overnight.
Peristaltic pump Ismatec, Wertheim, Germany ISM830
Three way stop cock Discofix C Luer Lock 10 cm Braun, Melsungen, Switzerland 16500C
Three way stop cock Discofix 3SC Braun, Melsungen, Switzerland 4095146
Instruments
42 mm glass coverslips Menzel Gläser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany on request 0.13 – 0.16 mm thickness
Cannula 21G Becton, Dickinson and Company, Franklin Lake, NY, USA 304432 Cut to a length of ~ 5 mm, roughened with sandpaper.
Coverslips for Neubauer cytometer 24 x 24 mm Menzel Gläser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany on request 0.38 – 0.42 mm thickness
Graefe forceps, 0.5 mm tips, slight curve Fine Science Tools, Heidelberg, Germany 11151-10
LSM 710 NLO Carl Zeiss, Jena, Germany 63x 1.4 NA oil objective
Neubauer improved cytometer Labor Optik, Friedrichsdorf, Germany 1100000 Counting procedure: Wipe cytometer and coverslip provided with the counting chamber with 70 % ethanol. Press coverslip gently on the counting chamber so that the two glass surfaces are in contact and Newton's rings can be observed. Subsequently, 10 – 20 µl cell suspension can be applied to the edge of the coverslip to be sucked into the void by capillary action. Count the intact vs. defect myocytes using the squares of the cytometer grid which reflects 100 nl. Repeat counting procedure on the second grid provided on the cytometer. Calculate the density of cells in your original cell suspension by taking account of any dlutions and counting shortcuts.
POC-R2 Imaging Chamber Pecon, Erbach, Germany Cell suspension volume: 800 µl; desired plating density: ~ 1000 AM and ~ 10,000 VM
Spring scissors, 8 mm blades straight, blunt Fine Science Tools, Heidelberg, Germany 15025-10
Student dumont #7 forceps, inox Fine Science Tools, Heidelberg, Germany 91197-00
Student iris scissors, curved, 11.5 cm Fine Science Tools, Heidelberg, Germany 91461-11
Student iris scissors, straight, 11.5 cm Fine Science Tools, Heidelberg, Germany 91460-11
Student surcigal scissors, straight, sharp, 12 cm Fine Science Tools, Heidelberg, Germany 91402-12
Tissue forceps, 1×2 teeth, slim, 10 cm Fine Science Tools, Heidelberg, Germany 11023-10
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References

  1. Prosser, B. L., Ward, C. W., Lederer, W. J. Subcellular Ca2+ signaling in the heart the role of ryanodine receptor sensitivity. J Gen Physiol. 136 (2), 135-142 (2010).
  2. Wehrens, X. H., Lehnart, S. E., Marks, A. R. Intracellular calcium release and cardiac disease. Annu Rev Physiol. 67, 69-98 (2005).
  3. Cheng, H., Cannell, M. B., Lederer, W. J. Propagation of excitation-contraction coupling into ventricular myocytes. Pflugers Arch. 428 (3-4), 415-417 (1994).
  4. Williams, G. S., Chikando, A. C., Tuan, H. T., Sobie, E. A., Lederer, W. J., Jafri, M. S. Dynamics of calcium sparks and calcium leak in the heart. Biophys J. 101 (6), 1287-1296 (2011).
  5. Sperelakis, N., Rubio, R. orderly lattice of axial tubules which interconnect adjacent transverse tubules in guinea-pig ventricular myocardium. J Mol Cell Cardiol. 2 (3), 211-220 (1971).
  6. Soeller, C., Cannell, M. B. of the transverse tubular system in living cardiac rat myocytes by 2-photon microscopy and digital image-processing techniques. Circ Res. 84 (3), 266-275 (1999).
  7. Song, L. S., et al. et al. ryanodine receptors in the failing heart. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (11), 4305-4310 (2006).
  8. Oort, R. J., et al. Disrupted junctional membrane complexes and hyperactive ryanodine receptors after acute junctophilin knockdown in mice. Circulation. 123 (9), 979-988 (2011).
  9. Wagner, E., et al. Stimulated emission depletion live-cell super-resolution imaging shows proliferative remodeling of T-tubule membrane structures after myocardial infarction. Circ Res. 111 (4), 402-414 (2012).
  10. Asghari, P., Schulson, M., Scriven, D. R., Martens, G., Moore, E. D. Axial tubules of rat ventricular myocytes form multiple junctions with the sarcoplasmic reticulum. Biophys J. 96 (11), 4651-4660 (2009).
  11. Lukyanenko, V., Ziman, A., Lukyanenko, A., Salnikov, V., Lederer, W. J. Functional groups of ryanodine receptors in rat ventricular cells. J Physiol. 583 (Pt 1), 251-269 (2007).
  12. Shacklock, P. S., Wier, W. G., Balke, C. W. Local Ca2+ transients (Ca2+ sparks) originate at transverse tubules in rat heart cells. J Physiol. 487 (Pt 3), 601-608 (1995).
  13. Reynolds, J. O., et al. Junctophilin-2 is necessary for T-tubule maturation during mouse heart development. Cardiovasc Res. 100 (1), 44-53 (2013).
  14. Di Maio, A., Karko, K., Snopko, R. M., Mejia-Alvarez, R., Franzini-Armstrong, C. T-tubule formation in cardiac myocytes two possible mechanisms. J Muscle Res Cell Motil. 28 (4-5), 231-241 (2007).
  15. He, J., et al. Reduction in density of transverse tubules and L-type Ca(2+) channels in canine tachycardia-induced heart failure. Cardiovasc Res. 49 (2), 298-307 (2001).
  16. Heinzel, F. R., et al. Remodeling of T-tubules and reduced synchrony of Ca2+ release in myocytes from chronically ischemic myocardium. Circ Res. 102 (3), 338-346 (2008).
  17. Lyon, A. R., et al. Loss of T-tubules and other changes to surface topography in ventricular myocytes from failing human and rat heart. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6854-6859 (2009).
  18. Crossman, D. J., Ruygrok, P. N., Soeller, C., Cannell, M. B. Changes in the organization of excitation-contraction coupling structures in failing human heart. PLoS One. 6 (3), e17901 (2011).
  19. Kemi, O. J., et al. The effect of exercise training on transverse tubules in normal, remodeled, and reverse remodeled hearts. J Cell Physiol. 226 (9), 2235-2243 (2011).
  20. Sachse, F. B., et al. Subcellular structures and function of myocytes impaired during heart failure are restored by cardiac resynchronization therapy. Circ Res. 110 (4), 588-597 (2012).
  21. Arakel, E. C., et al. Tuning the electrical properties of the heart by differential trafficking of KATP ion channel complexes. J Cell Sciences. 127 (Pt 9), 2106-2119 (2014).
  22. Richards, M. A., et al. Transverse tubules are a common feature in large mammalian atrial myocytes including human. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (5), H1996-H2005 (2011).
  23. Trafford, A. W., Clarke, J. D., Richards, M. A., Eisner, D. A., Dibb, K. M. Calcium signalling microdomains and the t-tubular system in atrial mycoytes potential roles in cardiac disease and arrhythmias. Cardiovasc Res. 98 (2), 192-203 (2013).
  24. Greiser, M., Schotten, U. Dynamic remodeling of intracellular Ca2+ signaling during atrial fibrillation. J Mol Cell Cardiol. 58, 134-142 (2013).
  25. Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents. J Vis Exp. (77), 10-3791 (2013).
  26. Kaestner, L., et al. Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging. J Vis Exp. (31), (2009).
  27. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 288-298 (2011).
  28. King, N. M., et al. Mouse intact cardiac myocyte mechanics cross-bridge and titin-based stress in unactivated cells. J Gen Physiol. 137 (1), 81-91 (2011).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji, an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Arganda-Carreras, I., Fernandez-Gonzalez, R., Munoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. 3D reconstruction of histological sections Application to mammary gland tissue. Microsc Res Tech. 73 (11), 1019-1029 (2010).
  31. Liu, Z. Q. Scale space approach to directional analysis of images. Appl Opt. 30 (11), 1369-1373 (1991).
  32. Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochem Biophys Res Commun. 72 (1), 327-333 (1976).
  33. Watanabe, Y., et al. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).
  34. Kohl, T., Westphal, V., Hell, S. W., Lehnart, S. E. Superresolution microscopy in heart – cardiac nanoscopy. J Mol Cell Cardiol. 58, 13-21 (2013).

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Keywords: Cardiac MyocytesTransverse-axial Tubule System (TATS)Atrial MyocytesVentricular MyocytesSarcoendoplasmic ReticulumCalcium Release UnitsMembrane NetworksFluorescence ImagingConfocal MicroscopySuperresolution ImagingImage AnalysisQuantitative AnalysisPhysiological AdaptationDisease Changes
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Citer Cet Article
Wagner, E., Brandenburg, S., Kohl, T., Lehnart, S. E. Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles. J. Vis. Exp. (92), e51823, doi:10.3791/51823 (2014).
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