Isolatie, identificatie en zuivering van Muriene thymus epitheelcellen

Vroeg in T-cel ontwikkeling, zijn beenmerg hematopoietische stamcellen afgeleide multipotente voorlopercellen aangeworven om de cortex van de thymus, ondergaan inzet voor T afstamming en word T cel precursoren ^1. In de cortex, T-cel voorloper CD4-en CD8 dubbele ontkenning (DN) thymocytes uitbreiden en differentiëren in onvolwassen CD4 en CD8 dubbel positieve (DP) thymocytes, de vorming van een grote pool van voorouders met zeer variabele T-cel-receptoren ^1. Slechts een select MHC-beperkte subset van DP cellen CD4 en CD8 enkele positieve (SP) thymocyten worden, migreren naar de medulla van de thymus en differentiëren tot functioneel bevoegde rijpe T-cellen, een gebeurtenis die wordt aangeduid als positieve selectie ^{2- 6.} In tegenstelling, klonen van auto-reactieve thymocytes ondergaan negatieve selectie en verwijderd via apoptose, omgerekend naar regulatoire T-cellen voor zelf-tolerantie, of omgeleid naar intra-epitheliale lymfocyten voor doeleinden die nog niet duidelijk ^3,7-10.

In de thymus, thymus stromale cellen vormen een unieke micro-omgeving verschaffen signalen voor deze verschillende T cel ontwikkeling lot ^5,11,12. Thymus stromale cellen zijn samengesteld uit de thymus epitheelcellen (TEC) – waaronder corticale TEC's (cTECs) en medullaire TEC (mTECs), dendritische cellen, macrofagen, fibroblasten, endotheelcellen, neurale-kuif afgeleid pericytes en andere mesenchymale cellen ^13-15. Onder deze, TEC's zijn cruciaal in de verschillende stadia van de T-cel ontwikkeling ^1,2,16,17. Echter, het ontbreken van een robuuste manier om TEC te isoleren een uitgebreide kennis van hun functies ¹⁶ belemmerd. Vooral cTECs, die een driedimensionaal netwerk rond voorlopers in de cortex vormen, zijn essentieel voor positieve selectie ^13,18,19 om redenen die nog niet duidelijk. Eerdere studies die aanwijzingen in verband met de heterogeniteit en de rol van de TEC, meestal een beroep op morfologische en histologische gereedschap ¹³ </sup>. Onlangs werden de unieke rol van de TEC subsets aangepakt door genetische benaderingen in muismodellen ^12,20. Een robuuste en reproduceerbare manier om TEC te isoleren is fundamenteel voor onpartijdige karakterisering van TEC subsets, kwantitatieve en kwalitatieve evaluatie van de TEC-functies, en verduidelijking van de mechanismen te realiseren hoe cTECs ondersteunen positieve selectie.

Vanwege de zeldzaamheid van TEC in de thymus en de strakke interacties vormen ze in de intacte orgaan is de isolatie van TEC uitdagend. De hier beschreven protocol gebaseerd op de eerdere ontdekkingen momenteel verkrijgbare middelen, technieken en kennis van structuur en thymus stromale samenstelling. Bijna twee decennia geleden, werden verschillende procedures gemeld aan thymus weefsels ^21-27, waarbij verschillende enzymen werden gebruikt tijdens de spijsvertering, waaronder trypsine, collagenase en Dispase disaggregeren. Gray et al. tegenover deze enzymen in hun precedure ²⁸ en meldde een verbeterde method met een multiple-stap spijsvertering enzym cocktails ²⁹ dat werd op grote schaal gebruikt ^20,30. Deze werkwijze is een lange voorbereidingstijd en complexe digestie stappen en resulteert in variabele uiteindelijke cel aantallen en percentages TEC zelfs in dezelfde muizen cohort ^29,30. Enkele jaren geleden, Liberase onderzoek leerjaar enzym, met daarin sterk gezuiverd Collagenase en neutraal protease begon te worden gebruikt in de thymus weefsel dissociatie ^30. We beschrijven hier een Liberase spijsvertering-gebaseerd protocol, met geoptimaliseerde mechanische scheiding procedures, dat een groot aantal levensvatbare TEC levert vanaf muis thymus weefsels. .

Om gedissocieerde stromale cellen te verrijken, hebben eerdere studies ofwel gradiënten dichtheid of magnetische kraal scheiding ^21,29 gebruikt. Beide methoden leiden tot ernstige verlies van bepaalde populaties van thymus stromale cellen, met name de populatie van cTECs ^29. Cytotoxische eliminatie en panning technieken <sup> 31,32 zijn op grote schaal gebruikt voor uitputting of scheiding van lymfocyten in het veld immunologische ^12,31. Na vergelijking van deze technieken hebben we de huidige panning protocol voor verrijking van TEC. De zachte conditie tijdens de verrijking procedure leidt tot minder celdood en onpartijdige en verhoogde TEC herstel.

De geïsoleerde thymus celsuspensie in punt 3 beschreven kunnen direct worden aangebracht op cytometrische analyse stroom voor identificatie en karakterisatie van TEC subsets en dendritische cellen. Hoofdstuk 4 beschrijft een eenvoudige en handige manier om TEC subsets met multiparameter doorstroomcytometer identificeren. Voor experimenten die streven naar gezuiverd cTECs of mTECs, TEC verrijking en celsortering procedures te verkrijgen zijn te vinden in hoofdstuk 5 en 6.