Fare Cilt ve Saç Folikül Desenlendirme ve Duyusal Akson Morfoloji Analizi Uygulanması Düz Görüntüleme Dağı
Summary
Bu tür saç folikülleri ve sinir uçları gibi – – mekansal organizasyon farklı desen sergileyen Memeli cilt yapıları çeşitli bir dizi içerir. Düz bir montaj olarak cilt analiz deri yapıları tam kalınlığı yüksek çözünürlüklü görüntüler üretmek için bu doku 2-boyutlu geometri yararlanır.
Abstract
Cilt son derece heterojen bir dokudur. Intra-dermal yapılar saç folikülleri, arrector pili kasları, (örneğin Merkel hücre kümeleri gibi) epidermal uzmanlık, yağ bezleri, sinirler ve sinir uçları ve kılcal damarları içerir. Bu yapıların mekansal düzenlemesi sıkı bir mikroskopik ölçekte kontrol edilir – görüldüğü gibi, örneğin, tek bir saç folikülü içinde hücre türlerine düzenli düzenlemede – ve bir makroskopik ölçekte – saç binlerce hemen hemen aynı yönelimleri tarafından görülen cildin yerel bir bölge içinde folikül. Fiziksel olarak cilt kesit olmadan bu yapıların görselleştirme için bu organın 2 boyutlu geometri mümkündür. Bu protokol, biz fare deri, disseke sabit, geçirgenleştirildi, lekeli ve bozulmamış bir iki boyutlu nesnenin, düz bir montaj olarak açıklığa kavuşturulması olduğunu göstermektedir. Protokol opt derinin geniş alanlarda tam kalınlığı boyunca kendi bütünlüğü içinde cilt yapıların kolay görselleştirme sağlarnik bölümleme ve yeniden yapılanma. Bu yapıların görüntüler de vücut eksene konumu ve oryantasyonu ile ilgili bilgi ile entegre edilebilir.
Introduction
Cilt somato-duyu, izolasyon / termoregülasyonu ve bağışıklık savunma 1. önemli fonksiyonları ile vücudun en büyük organ biridir. Cilt gelişimi ve işlevi moleküler ve hücresel temelini anlama nedeniyle biyolojik sistem ve dermatoloji alaka olarak derinin temel öneme uzun süredir devam eden bir ilgi olmuştur. Memeli Cilt keratinositleri tabakalı katmanları, deri, bağ dokusu, saç köklerinin çeşitli, yağ bezleri, arrector pili kaslar, kan damarları ve afferent en azından bir düzine farklı sınıflarına (duyusal) sinir ve efferent de dahil olmak üzere çok-yapılar, çeşitli içerir elyaf (Şekil 1). Vücudun farklı bölgelerinde cilt karakteristik farklı tipleri ile ilişkilidir. En Memelilerde, neredeyse tüm vücut yüzeyi yoğun saç köklerinin ile doludur deri ile kaplıdır. [İnsanlar ve çıplak körfareler inci istisnalarıkalıptır.] Saç da özel epidermal desenleri (dermatoglyphs), ekzokrin bezleri ve duyu sinir uçları ile ilişkili ellerde ve ayaklarda, palmar yüzeylerinin eksik. Büyümesi, farklılaşması ve saç folikülü içindeki hücrelerin uzaysal düzenleme kontrolü hücresel ve moleküler olaylar organogenez 2'nin merkezi özelliklerinin çoğu, minyatür, her bir folikül sergiler gibi özel ilgi çekmektedir. Bu özellikler, kök hücrelerin varlığını ve bir kök hücre niş, tam hücre koreografisini geçişler ve embriyolojik ayrı bileşenlerden çok hücreli yapıların montaj dahil.
Bu makalede, kesme için yöntemleri açıklar, sabitleme, etiketleme, ve sağlam bir iki boyutlu levha gibi görüntüleme fare deri, bir "bütün montaj" ya da "düzlem monte" hazırlık olarak anılacaktır. Fare derisi nispeten ince olduğu için, düzleştirilmiş kayak tam kalınlığı boyunca görüntü mümkündürn geleneksel konfokal mikroskopi kullanılarak. Bu yapılar bu şekilde optik olarak kısımlara ayırma suretiyle tamamen yeniden inşa edilmesi için izin fiziksel kesit için ihtiyaç atlar için, memeli bir cilt görüntüleme için düz montaj yaklaşım teknik avantajlıdır. Neredeyse tüm cilt tek bir nesne olarak işlendiği için, yassı gövde eksene konumu ve oryantasyonu ile ilgili bilgileri korurken yaklaşım aynı zamanda vücut yüzeyinin birden çok bölgelerin görüntüleme kolaylaştırır monte edin. Son olarak, deri içinde yapılar tipik haliyle, böylece, belirli bir yapıda birden fazla temsilcileri görüntülerin toplanmasını kolaylaştıran, düzenli aralıklarla tekrar edilir desen bulunmaktadır. Bu özellikler, retina, nöronal morfoloji 3 çalışmaları için benzer avantajlara sahiptir, merkezi sinir sistemi, iki boyutlu bir parçası üzerinde çalışmak neurobiologists aşinadır.
Burada anlatılan düz monte yaklaşım özel utilit olduğunucilt iki boyutlu bir düzlem içinde nispeten büyük ölçekli mekansal organizasyon sergileyen yapıları incelemek için y. Merkel hücresi kümeleri, arrector pili kaslarının, yağ bezleri ve sinir uçları 4 – Büyük ölçekli mekansal organizasyon bir örnek saç köklerinin ve saç folikülü ilişkili yapıların koordineli kutupluluktur. Saç foliküllerinin cilt düzlemi ile ilgili olarak, ve cilt 2 boyutlu bir düzlem içinde yer folikül vektörünün bileşeni ile bir açı ile yönlendirilir, genel olarak her biri için tam olarak belirlenmiş olan vücut eksene göre bir oryantasyon sergilemektedir vücut üzerindeki konumu. Örneğin, rostral gelen geri noktasında saç folikülleri kaudal ve ayak dorsal yüzeyi saç distal proksimal gelen işaret. Saç folikülü yönlendirme düzlemsel hücre kutup sinyallemesi tarafından kontrol edilir (PCP, ayrıca adı doku polarite 5). Bu sinyalizasyon sistemi Drosophila keşfedilmiştir burada küçük birÇekirdek PCP gen grubu cuticular saç ve kılların yönünü kontrol etmek için bulunmuştur. EGF yedi-pass G-reseptörü tip 1 (Celsr1) ve vang benzeri 2 (Vangl2) LAG cadherin frizzled homolog 6 (ayrıca FZ6 olarak anılacaktır Fzd6,) -, – PCP çekirdek genlerinin üç memeli orthologues memeli de benzer bir rol oynar cilt, vücut eksenleri ile saç köklerinin yönelimleri koordine. PCP sinyal yokluğunda birincil kusur köklerinin iç yapısı üzerinde herhangi bir etki ile, saç folikülü yönelimin bir başlangıç rasgele ya da düzensizlik olduğunu göstermektedir FZ6 knockout farelerde (- / – bundan sonra FZ6 olarak adlandırılan Fzd6 tm1Nat) Çalışmaları 6-8. Ikinci bir non-PCP sistemi, kıvrımları ve püskül gibi büyük ölçekli saç kalıplarının üretimine yol açan at köklerinin, yerel hizalama temin etmek için, daha sonra hareket eder.
Büyük ölçekli bir ikinci örneğicilt içinde mekansal organizasyon duyusal akson milleri morfolojilerinde görülür. Cildi canlandıran duyusal nöronlar dorsal kök ve trigeminal ganglionlarda hücre organları var. Bu nöronlar, sıcaklık, ağrı, kaşıntı ve deri ve saç üzerine çarpan 9 mekanik deformasyonlar çeşitli algılar. Bunlar, akson çap ve iletim hızı, sinir ucu uç yapısı ve reseptörleri, kanalları ve diğer moleküllerin ifade duruma göre, alt tiplere ayrılabilir. Çünkü cilt içinde innervasyon yüksek yoğunluklu, yani (tek hücre tipi bir flüoresan raportör ekspresyonu ile işaretlenir zaman olduğu gibi) her aksonlar (örneğin, anti-sinir lifi immün) ya da bir tek sınıfın hatta tüm aksonlar görselleştirme içeren analiz genellikle imkansız bir bireyin çardak morfolojisini tanımlamak için yapar akson yoğun bir süperpozisyon ortaya koymaktadır. Bu sorunu aşmak için, biz son derece seyrek genetik-yönettiği l kullanmışabeling tek tek iyi izole edilmiş akson milleri bir histokimyasal muhabir, insan plasental alkali fosfataz 10 ekspresyonu ile görüntülenmiştir edildiği dorsal deri örneklerini üretmek için. Bu yaklaşım, bireysel akson çardak morfolojilerin kesin görselleştirme ve morfolojik kriterlere dayalı somatosensori nöron türlerinin bir tanımını verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yukarıda açıklanan diseksiyon yöntemlerinin ustalık sadece sabır, sürekli bir el, ve birkaç iyi diseksiyon araçlar gerektirir. Sırt derisi diseksiyon nispeten kolaydır, ama kuyruk ve ayak cilt diseksiyonlar – Özellikle doğum sonrası erken yaşta – daha zor. (E15 önce örneğin) erken prenatal yaşlarda, cilt yırtmadan kaldırmak zordur. Uygun bir şekilde, büyüme ve farelerde deri yapıları modelleme birçok çalışmalar için, ilgi konusu olaylar arrector pili kas 19 büyümesini…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Amir Rattner for helpful comments on the manuscript. Supported by the Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate (BCIP) | Roche | 11383221001 | |
| AM1-43 | Biotium | 70024 | |
| AM4-65 | Biotium | 70039 | |
| Benzyl alcohol | Sigma | 402834 | |
| Benzyl benzoate | Sigma | B-6630 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Cy3-alpha smooth muscle actin antibody | Sigma | C6198 | 1:400 |
| Cytokeratin-8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-c | 1:500 |
| Dissecting microscope | |||
| Dissection tools | Fine Science Tools | scissors and forceps | |
| Electric razor | |||
| Fluoromount G | EM Sciences | 17984-25 | |
| Formalin | Sigma | HT501320 | |
| Glass dishes | Pyrex | 6 cm and 10 cm diameter | |
| Glass plates | Amersham Biosciences | SE202P-10 | 10 cm x 8 cm x 1 mm |
| Hair remover | Nair | ||
| Horizontal rotating platform | Hoefer | PR250 Orbital shaker | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Ketamine/xylazine | Sigma | K113 | |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Roche | 11383213001 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-055 | |
| Secondary antibodies | Invitrogen | Alexa-dye conjugated | |
| Sylgard-184 | Fisher Scientific | NC9020938 | |
| Tissue culture plastic dishes | 10 cm diameter | ||
| Tissue culture plates | 6- and 12-well |
References
- Burns, T., Breathnach, S., Cox, N., Griffiths, C. . Rook’s Textbook of Dermatology. 8th ed. , (2010).
- Lee, J., Tumbar, T. Hairy tale of signaling in hair follicle development and cycling. Semin. Cell Dev. Biol. 23, 906-916 (2012).
- Masland, R. H. The neuronal organization of the retina. Neuron. 76, 266-280 (2012).
- Chang, H., Nathans, J. Responses of hair follicle-associated structures to loss of planar cell polarity signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, (2013).
- Wallingford, J. B. Planar cell polarity and the developmental control of cell behavior in vertebrate embryos. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 28, 627-653 (2012).
- Guo, N., Hawkins, C., Nathans, J. Frizzled6 controls hair patterning in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 9277-9281 (2004).
- Wang, Y., Badea, T., Nathans, J. Order from disorder: Self-organization in mammalian hair patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 19800-19805 (2006).
- Wang, Y., Chang, H., Nathans, J. When whorls collide: the development of hair patterns in frizzled 6 mutant mice. Development. 137, 4091-4099 (2010).
- Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. Mechanisms of sensory transduction in the skin. Nature. 445, 858-865 (2007).
- Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, (2012).
- Bianchi, N., Depianto, D., McGowan, K., Gu, C., Coulombe, P. A. Exploiting the keratin 17 gene promoter to visualize live cells in epithelial appendages of mice. Mol. Cell. Biol. 25, 7249-7259 (2005).
- Alonso, L., Fuchs, E. The hair cycle. J. Cell Sci. 119, 391-393 (2006).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 30, 5241-5255 (2003).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J. Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Rotolo, T., Smallwood, P. M., Williams, J., Nathans, J. Genetically-directed, cell type-specific sparse labeling for the analysis of neuronal morphology. PLoS One. 3, (2008).
- Devenport, D., Fuchs, E. Planar polarization in embryonic epidermis orchestrates global asymmetric morphogenesis of hair follicles. Nat. Cell Biol. 10, 1257-1268 (2008).
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147, 1615-1627 (2011).
- Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).
- Fujiwara, H., et al. The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche. Cell. 144, 577-589 (2011).
- Orsini, M. W. Technique of preparation, study and photography of benzyl-benzoate cleared material for embryological studies. J. Reprod. Fertil. 3, 283-287 (1962).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Aal Ertürk, ., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat. Methods. 10, 508-513 (2013).
