Flat Mount Imaging de ratón de la piel y su aplicación al análisis del folículo del pelo Patrones y sensorial Axon Morfología

La piel es uno de los órganos más grandes del cuerpo, con funciones importantes en somato-sensación, aislamiento / termorregulación, y la defensa inmune ^1. La comprensión de las bases moleculares y celulares del desarrollo y función de la piel le ha interesado desde hace mucho tiempo debido a la importancia fundamental de la piel como un sistema biológico y su importancia para la dermatología. Piel de los mamíferos contiene una variedad de estructuras multicelulares, incluyendo capas estratificadas de queratinocitos, tejido conectivo dérmico, varios tipos de folículos pilosos, glándulas sebáceas, músculos erectores del pelo, vasos sanguíneos, y al menos una docena de distintas clases de aferentes (sensoriales) y el nervio eferente fibras (Figura 1). Diferentes regiones del cuerpo se asocian con característicamente diferentes tipos de piel. En la mayoría de los mamíferos, casi toda la superficie del cuerpo está cubierta de piel que está densamente poblada por los folículos pilosos. [Los seres humanos y las ratas topo desnudas constituyen excepciones a thes patrón.] Hair no se encuentra en las superficies palmar de las manos y los pies, que también están asociados con patrones especializados epidérmicos (dermatoglifos), glándulas exocrinas, y las terminaciones nerviosas sensoriales. Los eventos celulares y moleculares que controlan el crecimiento, la diferenciación, y la disposición espacial de las células dentro del folículo piloso son de especial interés como cada folículo exposiciones, en miniatura, muchas de las características centrales de la organogénesis ^2. Estas características incluyen la existencia de células madre y un nicho de células madre, las migraciones celulares precisamente coreografía, y el montaje de estructuras multicelulares de componentes embrionarias diferenciadas.

Este artículo describe métodos para la disección, la fijación, el etiquetado, y la piel de imágenes de ratón como una lámina bidimensional intacto, a que se refiere como una preparación de "todo el montaje" o "plano de montaje". Dado que la piel del ratón es relativamente delgada, es posible a la imagen a través del espesor completo de esquí aplanadaN utilizando microscopía confocal convencional. El enfoque plana de montaje de formación de imágenes la piel de mamíferos es técnicamente ventajoso porque evita la necesidad de seccionamiento física, permitiendo así que las estructuras a ser reconstruidas en su totalidad por seccionamiento óptico. Puesto que casi toda la piel se procesa como un único objeto, el plano de montaje enfoque también facilita la obtención de imágenes de múltiples regiones de la superficie del cuerpo, mientras que la preservación de la información acerca de la posición y orientación relativa a los ejes del cuerpo. Por último, las estructuras dentro de la piel están típicamente presentes en patrones que se repiten a intervalos regulares, facilitando de este modo la colección de imágenes de múltiples representantes de una estructura dada. Estas características son familiares para los neurobiólogos que trabajan en la retina, una parte de dos dimensiones del sistema nervioso central que goza de ventajas análogas para los estudios de la morfología neuronal ^3.

El enfoque plana de montaje se describe aquí es de utilit especialy para el estudio de las estructuras que exhiben organización espacial en una escala relativamente grande en el plano de dos dimensiones de la piel. Un ejemplo de organización espacial a gran escala es la polaridad coordinada de los folículos pilosos y las estructuras del folículo asociada el cabello – grupos de células de Merkel, los músculos erectores del pelo, glándulas sebáceas y terminaciones nerviosas ^4. Los folículos pilosos se orientan en un ángulo con respecto al plano de la piel, y la componente del vector folículo que se encuentra dentro del plano 2-dimensional de la piel generalmente exhibe una orientación con respecto a los ejes del cuerpo que es determinado con precisión para cada posición en el cuerpo. Por ejemplo, los folículos del pelo en el punto de vuelta de rostral a caudal y el pelo en la superficie dorsal de los pies apuntan de proximal a distal. Orientación del folículo del pelo es controlada por la polaridad celular planar de señalización (PCP, también llamada la polaridad del tejido ^5). Este sistema de señalización se descubrió en Drosophila donde una pequeñafue encontrado conjunto de genes de PCP centrales para controlar la orientación de los pelos y cerdas cuticulares. Tres ortólogos de mamíferos de genes de PCP centrales – homólogos frizzled 6 (Fzd6, también conocida como Fz6), cadherina EGF LAG de siete pasadas tipo G del receptor 1 (Celsr1), y-vang como 2 (Vangl2) – desempeñan funciones análogas en los mamíferos la piel, la coordinación de las orientaciones de los folículos del pelo con los ejes corporales. Los estudios de ratones knockout FZ6 (Fzd6 ^tm1Nat, denominado en lo sucesivo Fz6 ^{– / -)} muestran que el defecto primario en la ausencia de la señalización de PCP es una aleatorización inicial o la desorganización de la orientación del folículo piloso, con ningún efecto sobre la estructura intrínseca de los folículos ^6-8. Un segundo sistema no PCP actúa después para promover la adaptación local de los folículos cercanos, lo que conduce a la producción de patrones de pelo a gran escala, tales como espirales y mechones.

Un segundo ejemplo de gran escalaorganización espacial dentro de la piel se ve en las morfologías de cenadores axones sensoriales. Las neuronas sensoriales que inervan la piel tienen sus cuerpos celulares en la raíz dorsal y los ganglios del trigémino. Estas neuronas detectan la temperatura, el dolor, picor, y varios tipos de deformaciones mecánicas que inciden en la piel y el cabello ^9. Se pueden dividir en subtipos sobre la base de diámetro del axón y la velocidad de conducción, la estructura final del nervio terminal, y los patrones de expresión de los receptores, canales, y otras moléculas. Debido a la alta densidad de inervación dentro de la piel, los análisis que implican la visualización de todos los axones (por ejemplo, la inmunotinción anti-neurofilamentos) o incluso todos los axones de una sola clase (como se ve cuando un solo tipo de células se caracteriza por la expresión de un informador fluorescente) generalmente revela una superposición densa de axones que hace que sea imposible definir la morfología de un árbol individual. Para evitar este problema, hemos utilizado extremadamente escasa L genéticamente dirigidoAbeling para producir muestras dorsales de la piel en la que los cenadores axón bien aisladas individuales se visualizaron mediante la expresión de un reportero histoquímica, fosfatasa alcalina placentaria humana ^10. Este enfoque permite la visualización sin ambigüedades de morfologías cenador axón individuales y una definición de tipos de neuronas somatosensoriales basadas en criterios morfológicos.