شقة التصوير من جبل ماوس الجلد وتطبيقه على تحليل الشعر جريب الزخرفة والحسية أكسون الصرف
Summary
يحتوي الجلد الثدييات مجموعة متنوعة من هياكل – مثل بصيلات الشعر والنهايات العصبية – التي تظهر أنماط مميزة من التنظيم المكاني. تحليل الجلد مثل جبل مسطح يستفيد من الهندسة 2 الأبعاد من هذا النسيج لإنتاج كامل سمك صور عالية الدقة من الهياكل الجلد.
Abstract
الجلد هو نسيج غير متجانس للغاية. وتشمل الهياكل داخل بصيلات الشعر عن طريق الجلد والعضلات مقف الشعرة، التخصصات البشرة (مثل مجموعات الخلايا ميركل) والغدد الدهنية والأعصاب والنهايات العصبية، والشعيرات الدموية. يتم التحكم في الترتيب المكاني لهذه الهياكل بإحكام على نطاق والمجهرية – كما رأينا، على سبيل المثال، في ترتيب منظم من أنواع الخلايا داخل بصيلات الشعر واحد – وعلى نطاق والعيانية – كما يراها توجهات متطابقة تقريبا الآلاف من الشعر جريبات داخل المنطقة المحلية من الجلد. تصور هذه الهياكل دون باجتزاء جسديا الجلد ممكن لأن للهندسة 2 الأبعاد لهذا الجهاز. في هذا البروتوكول، وتبين لنا أن الجلد الماوس يمكن تشريح، ثابتة، permeabilized، الملون، وأوضحت أنها سليمة اثنين الكائن الأبعاد، وهو جبل مسطح. بروتوكول يسمح التصور من السهل الهياكل الجلد في مجملها من خلال سمك كامل من مناطق واسعة من الجلد عن طريق التقيدباجتزاء كال وإعادة الإعمار. ويمكن أيضا صورا لهذه الهياكل أن تكون متكاملة مع المعلومات حول الموقف والتوجه النسبية لمحاور الجسم.
Introduction
الجلد هو واحد من أكبر الأجهزة في الجسم، مع وظائف هامة في somato-ضجة كبيرة، والعزل / الحراري، والدفاع المناعي 1. وقد فهم الأساس الجزيئي والخلوي للتنمية وظيفة الجلد من الاهتمام منذ فترة طويلة بسبب الأهمية الأساسية للالجلد كنظام البيولوجية وصلته الأمراض الجلدية. يحتوي الجلد الثدييات مجموعة متنوعة من هياكل متعددة الخلايا، بما في ذلك طبقات من الخلايا القرنية الطبقية، والنسيج الضام الجلدي، عدة أنواع من بصيلات الشعر والغدد الدهنية والعضلات مقف الشعرة، والأوعية الدموية، وما لا يقل عن اثني عشر فئات متميزة من وارد (الحسية) وصادر العصبية الألياف (الشكل 1). وترتبط مناطق مختلفة من الجسم مع أنواع مختلفة من الجلد بشكل مميز. في معظم الثدييات، وتغطي ما يقرب من سطح الجسم كله مع الجلد التي تعج بصيلات الشعر. [البشر والفئران الخلد عارية تشكل استثناءات لعشرهو النمط.] هو الشعر مفقودة من السطوح الراحي من اليدين والقدمين، والتي ترتبط أيضا مع أنماط المتخصصة البشرة (dermatoglyphs) والغدد خارجية الإفراز، والنهايات العصبية الحسية. الأحداث الخلوية والجزيئية التي تتحكم في النمو، والتمايز، والترتيب المكاني للخلايا داخل بصيلات الشعر هي التي تحظى باهتمام خاص حيث أن كل المعروضات المسام، في مصغرة، العديد من الميزات المركزية للتوالد 2. وتشمل هذه الميزات وجود الخلايا الجذعية والخلايا الجذعية المتخصصة، والهجرات الخلية فشلت وجه التحديد، وتجميع هياكل متعددة الخلايا من مكونات متميزة جنيني.
توضح هذه المقالة الطرق للتشريح، وتحديد ووضع العلامات، والجلد الماوس التصوير باعتباره ورقة ثنائية الأبعاد سليمة، ويشار إليه على أنه "جبل بأكمله" أو "جبل مسطح" التحضير. منذ الجلد الماوس رقيقة نسبيا، فمن الممكن أن الصورة من خلال سمك كامل من التزلج بالارضن باستخدام المجهر متحد البؤر التقليدية. نهج جبل مسطح لتصوير الجلد الثدييات هو مفيد من الناحية الفنية لأنه يتجاوز الحاجة إلى باجتزاء المادية، مما يسمح الهياكل من أجل إعادة بنائها بالكامل من قبل باجتزاء البصرية. منذ ما يقرب تتم معالجة الجلد بأكمله ككائن واحد، وشقة جبل يسهل أيضا النهج التصوير من مناطق متعددة من سطح الجسم مع الحفاظ على المعلومات حول الموقف والتوجه النسبية لمحاور الجسم. أخيرا، والهياكل داخل الجلد وعادة ما تكون موجودة في الأنماط التي تتكرر على فترات منتظمة، مما يسهل جمع الصور من ممثلي متعددة من بنية معينة. هذه الخصائص هي مألوفة لبيولوجيا عصبية الذين يعملون على شبكية العين، وهي جزء ثنائي الأبعاد من الجهاز العصبي المركزي الذي تتمتع بمزايا مماثلة لدراسات مورفولوجيا الخلايا العصبية 3.
في جبل النهج شقة الموصوفة هنا هو من الفاءده خاصةذ لدراسة الهياكل التي تظهر التنظيم المكاني على نطاق واسع نسبيا داخل الطائرة ثنائية الأبعاد من الجلد. مثال واحد من التنظيم المكاني على نطاق واسع هو قطبية منسقة من بصيلات الشعر والهياكل المرتبطة بصيلات الشعر – مجموعات الخلايا ميركل، مقف العضلات الشعرة والغدد الزهمية، والنهايات العصبية 4. موجهة بصيلات الشعر في زاوية مع الاحترام لطائرة من الجلد، والمكون من ناقلات المسام التي تقع داخل الطائرة 2 الأبعاد من الجلد يسلك عموما التوجه فيما يتعلق محاور الهيئة التي تحدد بدقة لكل موقف على الجسم. على سبيل المثال، بصيلات الشعر على نقطة مرة أخرى من منقاري إلى الذيلية والشعر على السطح الظهري للقدم إشارة من الأقرب إلى القاصي. يتم التحكم جريب الشعر التوجه مستو قطبية الخلية إشارة (PCP؛ تسمى أيضا قطبية الأنسجة 5). تم اكتشاف هذا النظام الإشارات في ذبابة الفاكهة حيث صغيرةتم العثور على مجموعة من الجينات PCP الأساسية للتحكم في اتجاه الشعر جليدية وشعيرات. ثلاثة orthologues الثدييات من الجينات الأساسية PCP – homolog مقلى 6 (Fzd6، كما يشار إلى FZ6)، كادهيرين صندوق تعديل العولمة الأوروبي بفارق سبع تمريرة G-نوع مستقبلات 1 (Celsr1)، ومثل فانغ 2 (Vangl2) – تلعب أدوارا مماثلة في الثدييات الجلد وتنسيق توجهات بصيلات الشعر مع محاور الجسم. دراسات FZ6 الفئران خروج المغلوب (Fzd6 tm1Nat، يشار إليها فيما FZ6 – / -) تشير إلى أن الخلل الأساسي في غياب إشارات PCP هو التوزيع العشوائي الأولي أو الفوضى من التوجه بصيلات الشعر، مع عدم وجود تأثير على هيكل لا يتجزأ من بصيلات 6-8. يعمل نظام غير PCP الثانية في وقت لاحق إلى تعزيز التوافق المحلية من بصيلات المجاورة، الأمر الذي يؤدي إلى إنتاج أنماط الشعر على نطاق واسع مثل جدلات وخصلات.
والمثال الثاني على نطاق واسعويعتبر التنظيم المكاني داخل الجلد في الأشكال التضاريسية من العرش محوار الحسية. الخلايا العصبية الحسية التي يعصب الجلد لديهم أجسام الخلايا في الجذر الظهرية والعقد الثلاثي التوائم. هذه الخلايا العصبية كشف عن درجة الحرارة، والألم، وحكة، وأنواع مختلفة من التشوهات الميكانيكية التي تؤثر على الجلد والشعر 9. ويمكن تقسيمها إلى أنواع فرعية على أساس القطر محوار وسرعة التوصيل، ومحطة بنية نهاية العصبية، وأنماط التعبير من المستقبلات، وقنوات، والجزيئات الأخرى. بسبب كثافة عالية من تعصيب داخل الجلد، التحليلات التي تنطوي على تصور كل المحاور (على سبيل المثال، المناعية المضادة للخيط عصبي) أو حتى جميع محاور عصبية من فئة واحدة (كما رأينا عندما تم وضع علامة على نوع من الخلايا واحد عن طريق التعبير عن مراسل الفلورسنت) عموما يكشف تراكب كثيفة من المحاور التي تجعل من المستحيل تحديد مورفولوجية جذع الفردية. للتحايل على هذه المشكلة، ونحن قد استخدمت متفرق للغاية موجهة وراثيا لabeling لإنتاج عينات الجلد الظهرية التي هي تصور الفرد العرش محوار معزولة جيدا عن طريق التعبير عن مراسل النسيجية، الإنسان الفوسفاتيز القلوي المشيمة 10. هذا النهج يسمح التصور لا لبس فيها الفرد الأشكال التضاريسية محوار الشجرة وتعريف أنواع الخلايا العصبية الحسية الجسدية بناء على معايير مورفولوجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
إتقان أساليب تشريح المذكورة أعلاه يتطلب الصبر فقط، مطرد من ناحية، وعدد قليل من الأدوات تشريح جيدة. تشريح الجلد الظهري من السهل نسبيا، ولكن الذيل والجلد القدم تشريح – وخاصة في سن مبكرة بعد الولادة – هي أكثر تحديا. في سن مبكرة قبل الولادة (على سبيل المثال، قبل E15)، وا…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Amir Rattner for helpful comments on the manuscript. Supported by the Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate (BCIP) | Roche | 11383221001 | |
| AM1-43 | Biotium | 70024 | |
| AM4-65 | Biotium | 70039 | |
| Benzyl alcohol | Sigma | 402834 | |
| Benzyl benzoate | Sigma | B-6630 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Cy3-alpha smooth muscle actin antibody | Sigma | C6198 | 1:400 |
| Cytokeratin-8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-c | 1:500 |
| Dissecting microscope | |||
| Dissection tools | Fine Science Tools | scissors and forceps | |
| Electric razor | |||
| Fluoromount G | EM Sciences | 17984-25 | |
| Formalin | Sigma | HT501320 | |
| Glass dishes | Pyrex | 6 cm and 10 cm diameter | |
| Glass plates | Amersham Biosciences | SE202P-10 | 10 cm x 8 cm x 1 mm |
| Hair remover | Nair | ||
| Horizontal rotating platform | Hoefer | PR250 Orbital shaker | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Ketamine/xylazine | Sigma | K113 | |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Roche | 11383213001 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-055 | |
| Secondary antibodies | Invitrogen | Alexa-dye conjugated | |
| Sylgard-184 | Fisher Scientific | NC9020938 | |
| Tissue culture plastic dishes | 10 cm diameter | ||
| Tissue culture plates | 6- and 12-well |
References
- Burns, T., Breathnach, S., Cox, N., Griffiths, C. . Rook’s Textbook of Dermatology. 8th ed. , (2010).
- Lee, J., Tumbar, T. Hairy tale of signaling in hair follicle development and cycling. Semin. Cell Dev. Biol. 23, 906-916 (2012).
- Masland, R. H. The neuronal organization of the retina. Neuron. 76, 266-280 (2012).
- Chang, H., Nathans, J. Responses of hair follicle-associated structures to loss of planar cell polarity signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, (2013).
- Wallingford, J. B. Planar cell polarity and the developmental control of cell behavior in vertebrate embryos. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 28, 627-653 (2012).
- Guo, N., Hawkins, C., Nathans, J. Frizzled6 controls hair patterning in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 9277-9281 (2004).
- Wang, Y., Badea, T., Nathans, J. Order from disorder: Self-organization in mammalian hair patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 19800-19805 (2006).
- Wang, Y., Chang, H., Nathans, J. When whorls collide: the development of hair patterns in frizzled 6 mutant mice. Development. 137, 4091-4099 (2010).
- Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. Mechanisms of sensory transduction in the skin. Nature. 445, 858-865 (2007).
- Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, (2012).
- Bianchi, N., Depianto, D., McGowan, K., Gu, C., Coulombe, P. A. Exploiting the keratin 17 gene promoter to visualize live cells in epithelial appendages of mice. Mol. Cell. Biol. 25, 7249-7259 (2005).
- Alonso, L., Fuchs, E. The hair cycle. J. Cell Sci. 119, 391-393 (2006).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 30, 5241-5255 (2003).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J. Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Rotolo, T., Smallwood, P. M., Williams, J., Nathans, J. Genetically-directed, cell type-specific sparse labeling for the analysis of neuronal morphology. PLoS One. 3, (2008).
- Devenport, D., Fuchs, E. Planar polarization in embryonic epidermis orchestrates global asymmetric morphogenesis of hair follicles. Nat. Cell Biol. 10, 1257-1268 (2008).
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147, 1615-1627 (2011).
- Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).
- Fujiwara, H., et al. The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche. Cell. 144, 577-589 (2011).
- Orsini, M. W. Technique of preparation, study and photography of benzyl-benzoate cleared material for embryological studies. J. Reprod. Fertil. 3, 283-287 (1962).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Aal Ertürk, ., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat. Methods. 10, 508-513 (2013).
