Marcador de superfície celular Purificação Mediada de iPS Intermediários celulares a partir de um modelo Reprogramável mouse

1 Instrumento Settings / Preparação do reagente / Genotipagem Preparar meio de células iPS: Suplemento 500 ml Knockout meio DMEM com soro fetal bovino 75 ml (FBS), 5 ml de L-glutamina, 5 ml de aminoácidos não-essenciais, 500 ul β-mercaptoetanol 5 x 10 5 unidades de factor inibidor da leucemia ( LIF). Consulte a Lista de Materiais para o produto e informações de compra de reagentes utilizados no contexto deste manuscrito. Preparar meio MEF: Suplemento 500 ml meio DMEM com FBS a 50 ml, 5 ml de L-glutamina, 5 ml de aminoácidos não-essenciais, 5 mL de piruvato de sódio, 500 uL β-mercaptoetanol. Preparar meio de congelamento: Para 10 mL, combinar 9 ml de FBS com 1 ml de DMSO. Gelatina Prepara pratos revestidos Adicionar solução de gelatina porcina 3-5 mL de 0,1% para um frasco T75 e incubar à temperatura ambiente durante pelo menos 10 min e aspirado imediatamente antes do uso. Prepare FACS meio rotulagem: Para 10 mL, 9,9 mL combinar de PBS com 0,1 ml de FBS. Realizeuma genotipagem de PCR para o locus Rosa26 m2rtTA: Realizar as reacções com polimerase do ADN de Taq de acordo com as instruções do fabricante. Use uma modificação MgCl2 -concentration de 3,5 mm e os três seguintes primers: oIMR8052: 5 'GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC 3', oIMR8545: 5'AAA GTC GCT CTG AGT TAT TGT 3 ', oIMR8546: 5' GGA GCG GGA ATG GAA GAT ATG 3 '. Condições de ciclo: 94 ° C durante 3 min; 35 ciclos de (94 ° C durante 30 seg, 65 ° C durante 1 min, 72 ° C durante 1 min); 72 ° C durante 2 min; manter a 12 ° C. O tamanho esperado do produto: 650 pb para o alelo de tipo selvagem e 340 pb para o alelo mutante. Realize uma genotipagem PCR para o locus Collagen-StemCa / OKSM: Realizar reações com Taq DNA polimerase, conforme as instruções. Use uma modificação MgCl2 -concentration de 2,5 mM e os três iniciadores seguintes: col / frt-B: 5 'CCCTCCATGTGTGACCAAGG 3', col / frtA1: 5 'GCACAGCATTGCGGACATGC 3', col / frtC1: 5 'GCAGAAGCGCGGCCGTCTGG 3 '. Condições de ciclo: 95 ° C durante 1 minuto: 2 ciclos de (94 ° C durante 30 seg, 70 ° C durante 45 s), 6 ciclos de (94 ° C durante 30 seg, 68 ° C durante 45 seg) e 30 ciclos de (94 ° C durante 20 seg, 60 ° C durante 1 min); 72 ° C durante 5 min; manter a 12 ° C. O tamanho esperado do produto: 331 pb para o alelo tipo selvagem e 551 pb para o alelo mutante. Realizar todos os passos de centrifugação a 400 xg durante 3 minutos a 4 ° C. 2 Geração de rato embrionárias fibroblastos Realize um acasalamento cronometrado entre um animal da estirpe OKSM com um membro do sexo oposto da estirpe m2rtTA. Embriões colheita no dia embrionário 13,5 por abate a mãe e remover o corno uterino. Antes da remoção da trompa uterina, pulverizar a região abdominal com uma solução de etanol a 80%, para evitar a contaminação microbiana. Transferir a trompa uterina num prato de 10 cm de cultura de tecidos contendo 10 ml de Solução Salina Tamponada com Fosfato estéril (PBS). Use tesouras cirúrgicas esterilizadas de grau para cortar o corno uterino em pedaços contendo um embrião (ver Figura 3A, B). Use um microscópio de dissecção (idealmente situado dentro de uma cultura capa de tecido) e uma pinça esterilizada para remover cuidadosamente o envelope uterino e as membranas extra-embrionárias que cercam cada embrião. Transferir cada embrião para uma placa de 10 cm separado com 10 ml de PBS. Continuar removendo a cabeça do embrião, membros, cauda e dos órgãos internos (coração, fígado, intestino, etc), com as pinças (ver Figura 3C). Transferir a cabeça do embrião dentro de um tubo de 1,5 mL e congelar para baixo de modo que pode ser utilizado para genotipagem, se necessário. Transferir o tronco do embrião em um 10 centímetros prato vazio e usar duas lâminas cirúrgicas para picar o embrião por 2 min. Adicionar 200 ul de solução de tripsina / EDTA por cima do embrião picada e incubar durante 3-5 minutos à temperatura ambiente. Continue picados por um 2 min, adicione 2 ml de meio do MEF no ativar tripsina, e depois transferir para um tubo de 15 ml. Usar uma pipeta de 1000 ul de dissociar mais mecanicamente o tecido por pipetagem suave. Transferir para um gelatina revestida prato de 10 cm e adicionar um adicional de 10 ml de meio de MEF. Nota: Ambas as incubadoras normóxicas e de hipóxia pode ser usado para a cultura, referem-se a discussão para mais informações. Após 24-48 h, a placa deve ser densamente coberto com MEFs. Alternativamente, as células podem ser depois propagadas e congelado para baixo. Para o congelamento de células, remova o meio de cultura, lavar o prato com 10 ml de PBS para remover traços de mídia e sobreposição com 3 ml de tripsina / solução de EDTA. Incuba-se durante 3-5 minutos a 37 ° C, a digestão inactivar a tripsina por adição de 5 ml de meio de MEF e transferência para um tubo de centrifugação de 15 ml. Gire para baixo e colocar o agregado em 3 ml de mídia de congelamento. Transferir para 3 criotubos e congelar para baixo em um recipiente de congelamento de células. 3. Reprogramação de MEFs ove_content "> NOTA: as células por centrifugação a 200 xg por 5 min a 4 ° C e usar normóxicas incubadoras de cultura de tecidos para a reprogramação Ela pode ser benéfica para derivar e expandir MEFs sob condições de hipóxia (5% de oxigênio, veja a discussão para mais informações. ). Descongelar rapidamente um frasco de congelação baixa passagem (P0-P1, 2-3 células Mio) em um banho de água (37 ° C) e o seu conteúdo para um tubo com 10 ml de meio de MEF pré-aquecidas. Células de pellets, ressuspender em media MEF 12 ml fresco, transferir para uma gelatina revestido recipiente de cultura T75, e permitir que as células se recuperar para 24-48 horas antes de prosseguir. Nota: MEFs também pode ser utilizado directamente após a derivação. Após a remoção do meio de cultura, lavar com PBS e MEFs cellularize por sobreposição com uma solução de tripsina / EDTA (3 ml para 3-5 min a 37 ° C). Saciar a tripsina, adicionando 5 ml de meio MEF e dissociar ainda mais células por agitação suave com uma pipeta de 10 ml. Determinar o número de células utilizando um hemocitómetro. Para reprograexperimentos mming, MEFs semente em frascos T75 revestidos com gelatina a densidades de 6,7 x 10 células / 3 cm 2 (~ 0,5 milhões de células por frasco) em meios de IPSC contendo 2 ug / ml de doxiciclina. Consulte a Tabela 1 em relação a recomendações de semeadura para se obter cerca de 2 intermediários reprogramação milhões para cada ponto de tempo. Nota: A reprogramação começa com a adição de doxiciclina (2 mg / mL), suplementado mídia Para os primeiros 6 dias substituir mídia todos os dias com doxiciclina fresco suplementado mídia iPSC (12 ml por frasco de mídia T75). Além deste ponto renovar mídia diariamente se há o número de células de altura. Dobrar o volume de cultura se alterações na mídia só pode ser realizada em dias alternados. Intermediários Colheita de reprogramação nos momentos necessários (sugestão: dias 3, 6, 9, 12), removendo a mídia, a lavagem com volume adequado de PBS (10 ml para um frasco T75) e sobreposição com solução de tripsina-EDTA (3 ml para um frasco T75). Incubardurante 3-5 min a 37 ° C e extingue-se por adição de 5 ml de meio iPSC seguido por pipetagem suave. Contagem de suspensão de células com um hemocitómetro (ver acima), por centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 10 ml de PBS para remover quaisquer vestígios de tripsina. Agregar as células mais uma vez, aspirar o sobrenadante e prossiga com o passo 4.1 para isolar os intermediários de reprogramação. Nota: As células submetidas a reprogramação pode ser criopreservadas e descongeladas para FACS isolamento em um estágio posterior. Para estabelecer totalmente reprogramadas iPS culturas, cultivo de células em free-dox mídia iPSC por mais 4-7 dias. Nota: As culturas de reprogramação com sucesso irão conter um grande número de colónias por dia 12 (ver Figura 4). Durante este tempo, as células iPS aberrantes que ainda carecem de expressão OKSM desaparecerá. Alternativamente, para propagar as restantes culturas completamente reprogramadas iPS: inicialmente, as sementes MEFs irradiados a uma densidade de 15 x 10 3 células / cm 2 </sse> em 12 ml de meio iPSC Onto uma gelatina revestida T75 balão de um dia ou de 6 horas antes das experiências. Em seguida, as culturas de células iPS cellularize por meios de remoção, lavando o frasco T75 com 10 ml de PBS, sobrepondo com 3 ml de solução de tripsina-EDTA e incubando durante 3-5 min a 37 ° C. Saciar tripsina pela adição de 5 ml de mídia IPSC seguido de mistura suave, transferir para um tubo de 15 ml, girar para baixo e, em seguida, novamente suspensas em 10 ml de mídia iPS. Transferir 500 ul desta suspensão de células sobre os MEFs irradiados (frasco T75) e permitir que as culturas a crescer durante 4-5 dias. Nota: iPS estabelecidas as culturas podem ser criopreservados ou utilizados para experimentos. Linhagens de células clonais podem ser obtidas escolhendo colônias IPSC individuais sob um microscópio de dissecação 22. Cryo preservar culturas IPSC confluentes, conforme descrito no 2.8 para MEFs. 4 Rotulagem de anticorpos Pellets de células Ressuspender de culturas de reprogramação, elaborados na Seção 3, emFACS suplementado com meio de marcação de anticorpos (anti-Thy 1.2-pacífico azuis 1: 400, anti-biotina SSEA-1 1: 400 e anti-EpCAM Fitc 1: 400). Utilizar 200 ul de mistura de marcação suplementado por 5 milhões de células e incuba-se em gelo. Após 10 min de toque suave do tubo para ressuspender as células e incuba-se durante mais 10 min em gelo. Adicionar 10 ml de PBS frio por tubo e girar para baixo. Para cada um dos tubos a serem coradas preparar 200 mL de meio de marcação suplementados com 1 ul de estreptavidina-PeCy7 (1: 200) por 5 milhões de células. Quando as células foram sedimentadas, aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender em um volume apropriado de meio de marcação suplementados com Estreptavidina-PeCy7. Manter as células em gelo por 10 min, toque para voltar a suspender, incubar por mais 10 minutos no gelo, adicione 10 ml de PBS frio por tubo, girar e aspirar o sobrenadante. Os sedimentos de células em meio de marcação Ressuspender suplementado com iodeto de propídio (PI) (2 ug / ml) a cerca de 1 x 10 7 células / ml. Remover aglomerados de células fazendo passar a suspensão através de um filtro de 70 ^ m. Transferir as células para um tubo de FACS apropriado e mantê-los em gelo. Preparar amostras separadas com anticorpos individuais (anti-Thy-1.2, anti-SSEA-1 e anti-EpCAM). NOTA: Estes são necessários para executar a compensação de cor nos três canais utilizados na análise. Além disso, as células não marcadas são necessários para definir as tensões e portões para a classificação. Idealmente as células iPS são utilizados para compensação: as existências de 0,5-1 x 10 6 células iPS mantidos em MEFs irradiados são armazenados em criotubos em nitrogênio líquido. A presença de MEFs é essencial para obter um sinal no canal de Thy-1.2. Descongele a cryovial de células iPS como descrito para MEFs (Seção 3). Após a centrifugação, Ressuspender as células em 800 mL de tampão de rotulagem e 200 mL desta amostra é deixada de lado como o controle sem rótulo. Use as células restantes como controles de compensação. As células se dividem entre três tubos de 15 mL e anticorpos adicionarda seguinte forma: Pacific Blue Control compensação: adicionar 0,5 mL do anticorpo anti-Thy-1.2 Pacific Blue. Tubo de compensação Fitc: adicionar 0,5 mL de anticorpo anti-EpCAM-FITC. Pe-Cy7 controlo de compensação: 0,5 ul do anticorpo anti SSEA-1-Biotina. Manter as amostras de células-anticorpo no gelo por 10 min, misture tocando e incubar por 10 min no gelo. Lavar as amostras com 10 ml PBS fria para remover o anticorpo não ligado, girar células para baixo e aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em pelotas a 200 ul de meio de marcação de FACS. Para os anti-sseA-1-biotina amostras marcadas, adicione um conjugado estreptavidina-PeCy7 (1 ml por 200 células ul). Etiqueta de células como descrito para o anticorpo primário (SSEA-1-Biotina). Passar todas as amostras, incluindo o controlo não marcado através de um filtro de 70 ^ m e adicionar PI (2 ug / ml). Transfira as células para tubos de FACS e manter em gelo até serem necessárias. 5. FACS isolamento de intermediários Nota:As células são classificadas usando um classificador de células activadas por fluorescência com 405 nm, 488 nm e 560 nm de excitação laser e um bocal de 100 um. Configure tensões para dispersão frontal e lateral, para que a população de células é correctamente visualizado. Desenhar uma porta em torno das células, tal como indicado na Figura 5A a excluir detritos. Nota: A configuração correcta das tensões sobre a separação de células pode ser complexo e requer um operador experiente FACS. Use dispersão frontal (FSC) de altura em relação área FSC para excluir agregados (Figura 5B). Visualize o canal PI contra FSC para portão nas células vivas negativos PI (Figura 5C). Utilize as células não marcadas para ajustar as voltagens para os canais fluorescentes de PB, Fitc / GFP, Pe-Cy7. Idealmente posicionar a população de células na extremidade inferior do respectivo canal. Definir portas com as células de controlo não marcados como se mostra na Figura 6A, B a fracção sub culto reprogramaçãoUres para o dia 3, 6 e 9 populações: células + sseA-1 / Thy-1.2; SseA-1 / Thy-1.2-células; ea reprogramação intermedeia sseA-1 + / Thy-1.2-células. Além disso subdividir o dia 9 sseA-1 + / Thy-1.2- fração usando o Pe-Cy7 contra Fitc blot; desenhar portas em todo o SSE-a1 + / + EPCAM células e os sseA-1 + / células Epcam-. Definir portas com as células de controlo não marcados como se mostra na Figura 6C, D. Prefill tubos de coleta adequados com media de células iPS (1-2 ml) antes de classificar as subpopulações desejadas (veja a Figura 7 para perfis FACS representativos para MEFs, Dia 3 / Dia 6 / Dia 9 / Dia 12 culturas e células iPS). Efectuar a triagem FACS de acordo com o protocolo de fabrica. Após isolamento FACS submeter células a um perfil molecular (ARN / extracção de proteínas, a imunoprecipitação da cromatina, o DNA methylome análise etc). Alternativamente, as diferentes fracções de células podem ser cultivadas.