행동 경험에 따라 뇌 샘플에서 전사 역학의 종합 분석
Summary
This manuscript describes a protocol that applies comprehensive profiling for analysis of transcriptional programs induced in specific brain nuclei of rodents following behavioral paradigms. Herein, this approach is illustrated in the context of profiling genes induced in the nucleus accumbens (NAc) of mice following acute cocaine exposure, utilizing microfluidic qPCR arrays.
Abstract
뇌와 장기 기억의 통합 경험의 인코딩은 유전자 전사에 따라 달라집니다. 인코딩 환경에서 특정 유전자의 기능을 확인하는 것은 분자 신경의 주요 목적 중 하나이다. 또한, 고유의 동작으로 정의 유전자의 기능적 연관 신경 정신 질환의 기초를 이해하는 의미를 갖는다. 강력한 전사 프로그램의 유도는 다양한 행동 조작을 다음 쥐의 뇌에서 관찰되었다. 어떤 유전 요소가 다른 행동 다음 조작과 다른 뇌 핵에서 반복되는 사용되는 반면, 전사 프로그램은 전체적으로 자극 유도하고 그들이 1,2 연구되는 구조에 고유하다.
이 책에서, 프로토콜은 행동 조작에 대한 응답으로 쥐의 뇌 핵에서 강력하고 포괄적 인 전사 프로파일에 대해 설명한다.프로토콜은 급성 코카인 경험을 다음 중격 의지 핵에서 유전자 발현의 역학 분석의 맥락에서 설명된다. 생체 내 환경에서 정의 된 이후, 타겟 신경 조직은 해부; RNA를 정제 한 후, 다수의 표적 유전자의 광범위한 분석을 qPCR에 전사와 미세 유체 어레이의 이용을 역방향. 이 프로토콜은 이러한 작은 뇌 샘플 또는 하나의 세포로 종합적인 분석 출발 물질의 양을 제한하는 (50 ~ 500 유전자를 주소)에 맞도록한다.
프로토콜은 복수의 평행 한 샘플 분석 (예를 들어 단일 세포, 약학 다음 동적 분석, 바이러스 또는 행동 섭동)에 가장 유리하다. 그러나, 프로토콜은 또한 마이크로 어레이 또는 RNAseq하여 전체 게놈 연구에 앞서 샘플의 특성 및 품질 보증을 위해 제공뿐만 아니라, 전체 게놈 연구로부터 얻어진 데이터를 검증 할 수있다.
Introduction
뇌의 역동적 인 조직은인지 적, 행동 적 유연성을 제공합니다. 경험은 뇌 3 뉴런 간의 연결의 구조 및 강도의 변형을 통해 인코딩된다. 이러한 "경험에 의존하는 가소성"시냅스 구조와 강도 (4)의 수정을 위해 필요한 단백질을 제공하는 유전자 발현의 특정 패턴의 유도의 결과이다. 장기 기억의 형성을 매개 유전자 조절 네트워크의 식별은 전사 프로그램의 지배적 인 요소의 식별을위한 기억 형성뿐만 아니라, 타겟을 조절하는 근본적인 원리에 대한 통찰력을 제공 할 것으로 기대 분자 신경의 중앙 신조 신경 및 신경 정신 질환의 치료. 전사 프로그램 개발에 중요한 다른 캐릭터의 유전자를 인코딩하는 각각의 시간적 정의 파도 펼쳐시그널링 이벤트 1,2의 결과의 구현 ifferent 단계. 이 유도 된 유전자의 전체 보완을 식별하고, 그들의 유도의 역학에 따라 잠재적 기능에 대한 통찰력을 얻을 수 있도록, 자세한 시간 척도에 전사 역학을 해결하는 것이 중요하다.
마약 중독은 뇌 5,6의 신경 회로에 약물 남용의 긴 지속 효과에 의한 경험에 의존하는 가소성의 강력한 형태입니다. 약물에 초기, 급성 노출은 중독의 개발과 만성 사용으로의 전환으로 이어질 수 있습니다. 콘텍스트 정보는 중독의 개발에 중요한 요소이다. 의약품 관련 환경 단서 약물 남용자의 마음에 큰 중요성을 부여하고 있습니다. 약물 갈망에 재발을 유도 할 수있다 과거 마약 경험의 약물 남용을 상기 콘텐츠 정보도 약물 노출 7,8에서 금욕 오랜 기간을 다음과 같습니다.따라서 중독에서 좋은 임상 도전 – 금단 증상이 구를 가라 앉 후 중독자의 성향도 긴 재발합니다.
코카인에 행동 과민 반응은 약물 중독의 메커니즘의 연구에 유용 코카인 경험의 간단한 모델이다. 약물 남용에 만성 노출에 의해 유도 된 오래 지속되는 감작이 널리 연구 된 모델에서는 설치류는 첫째 식염수 주사 (복강; IP)에 순응하는 새로운 환경에서 (자신의 운동 활성을 모니터하는 오픈 필드 챔버) ; 자신의 활동이 10 (그림 1)를 모니터링하는 동안 다음, 그들은 열기 필드 챔버에서 코카인의 매일 주사를받을 수 있습니다. 행동이 패러다임은 일반적으로 변태의 형성을 보여주는, 코카인 주사 정지 다음 달의 기간 동안 유지된다 (8-12 배의 기준선 위의 활동) 전위 거동 (11)의 강력한 감작 초래마약 경험 asive 메모리 추적.
자연적으로 종의 성공 (예 : 공급, 성별)에 필수적인 행동을 강화에 관련된 보상의 신경 회로는, 약물 관련 행동 (12, 13)을 강화하는 약물 남용에 의해 이용된다. 남용 약물 경험이 향상되는 분자 및 세포 메커니즘은 다른 뇌 구조 (14) 또는 의미 선언적 기억의 형성을 기본 메커니즘과 유사한 것으로 보인다. 따라서, 행동 감작 모델의 견고성은 그것을 경험에 의존하는 가소성의 메커니즘을 연구하는 매력적인 모델 시스템을 만든다.
중격 의지 핵 (NAC)은 뇌의 보상 회로의 중앙 적분기이며, 광범위하게 5,6 중독의 발달과 관련이있다. 중독의 형성은 핵 중격 의지 소설 단백질의 전사에 의존하고있는 강력한명확하게 구조화 전사 프로그램 duction 코카인 경험 15-19 다음 NAC에서 관찰된다. 코카인 노출 급성 전사 응답이 강한 유도 자극에 적응하는 새로운 단백질의 생산을 유도하기 위하여 여러 레벨에서 기능 할 가능성이 6,19-22 약물에 대한 노출에 의해 유도 된 구조적 변화 및 전기 생리 책임이있다.
뇌에서의 경험에 의존하는 가소성의 분자 메커니즘의 연구를 촉진하기 위해, 프로토콜은 다음의 행동 조작 뇌 조직 샘플에 전사 역학의 포괄적 인 분석에 대한 설명한다. 전사 분석을 위해 마이크로 유체 동적 배열을 이용하여, 코카인으로 행동 감작 – 프로토콜 Citri 실험실 연구 행동 경험의 맥락에서 설명된다. 설명 된 프로토콜은 분명히 t 공부에 한정되지 않는다그 행동 감작의 컨텍스트에서 중격 의지 핵을하지만 행동 패러다임 및 뇌 영역의 다수의 적용 할 수있다. 실제로,이 프로토콜은 뇌 밖의 신체 조직에 적용 할 수 있고, 경험 또는 유기체의 조작의 다양한 연구.
이 프로토콜은 크게 네 단계로 구분된다. 첫 번째 단계에서, 동물은 행동 패러다임을 받는다; 두번째 단계에서 조직 microdissected이고; 세번째 단계에서 -는 mRNA를 정제하고 역전사-프로빙, 최종 단계에서 데이터를 분석한다.
전사 역학 연구의 맥락에서, 경험의 정밀한 타이밍 및 정의를 제어하는 가장 중요한 파라미터는 아마도 실험이다. 이러한 이유로, 우리가 선택한 행동 모델은 코카인으로 행동 감작, experien의 파라미터를 통해 제어 실험자의 높은 수준을 가능하게하는 시스템이다CE. 경험에 의존 소성 또는 기억 형성의 서로 다른 모델을 정확한 타이밍을 활성화하고 해결 추가 행동 패러다임을 사용할 수 있습니다. 이러한 모델은 두려움 컨디셔닝 (23), 미세 환경 농축 24, 25, 새로운 객체 탐사 (26)과 어두운 양육 27 다음 시각적 경험을 포함한다. 그러나 코카인에 행동 감작은 지속적으로 강력한 행동 조작 코카인 경험 (28) 다음 개월 동안 지속 매우 널리 보급 메모리 추적을 생성합니다.
뇌는 핵 중격 의지를 수동으로 미세 절제 한 후, 절단된다. 그것은 빠르게 준비 뇌 조각에서 수동 미세 절제가 행동 패러다임에 관련된 조직을 추출하는 가장 안전하고 빠른 방법을 제공하는 것이 우리의 경험이었고, 경험, 조직의 경계가 인식 쉽게 분명하게합니다. 또한, 미세 조각 위해 준비 될 수있다레이저 캡처 미세 절제 다음 에디션. 이 방법은 높은 관심 영역의 묘사를 정의 가능하게 있지만, (따라서 불안정한의 mRNA를 유실) 지루한 느리고 비용이 많이 드는 전용 장비 (레이저 캡처 설치가 장착 된 현미경)가 필요합니다. 본원에서 정의 된 프로토콜은 또한 패치 피펫 (29)를 사용하여 시각적으로 식별 된 세포의 세포질 수동 흡인에 의해, 단일 셀 전사 분석에 적용 할 수있다. 그것은 대부분의 경우, 조직 내 세포의 하위 집단 만이 실제로 경험에 대한 응답에 포함되어있을 가능성이 높은, 기재된 프로토콜 인구 평균을 제공한다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 그것은 경험에 응답 특정 세포 집단 내에서 선택적 방식으로 전사를 프로파일 관심이지만, 이러한 방식의 논의는 현재의 범위를 벗어납니다.
mRNA의 정화를 들어, 역 전사 및 qPCR에의 질의, 조직을시중에서 판매하는 키트의 활용 다음 미세 바늘을 통해 전달하여 중단됩니다 (자세한 내용은 표 8 참조). 선택은 높은 품질의 RNA 및 다운 스트림 응용 프로그램에서 강력한 결과의 신뢰성 추출을 위해 이러한 방법론, 경험에 의해 통보된다.
프로토콜이 동적 배열을 이용하는 높은 처리량 qPCR에 대해 설명되지만, 샘플 종점 PCR 낮은 처리량 qPCR에, 유전자 발현 마이크로 어레이 또는 깊은 시퀀싱을 이용하여 유전자 발현을위한 프로브 할 수있다. 높은 처리량 qPCR의 동적 배열을 이용하기위한 기본의 mRNA는이 행동 패러다임을 다음은 종종 제한적인 양의 인 뇌 핵으로부터 수득된다는 사실에 기인한다. 동적 배열 한 번의 실험에서 병렬 샘플로부터 다수의 효율적인 종합 성적 분석을 가능하게하는 플랫폼을 제공한다. 마이크로 유체 시스템의 초기 획득 (통상적 기관 PU 후에rchase) 실험을 실행하는 데 상대적으로 저렴하다. 이 분석에 따라, 샘플의 추가 쿼리는 동적 배열은 품질 보증을위한 포괄적 인 참조를 제공과 함께 (마이크로 어레이 또는 RNAseq에 의해) 새로운 성적표를 검색하기 위해 더 많은 비용이 많이 드는 플랫폼을 사용하여 수행 할 수있다. 마지막으로, 데이터 분석을위한 표준 방법이 이용된다. 발생할 수있는 문제점에 대해 특정 포인터 프로토콜의 텍스트 설명 될 것이다.
이 프로토콜은 여러 조건과 반복 실험을 공부하고 관심을 자신의 시스템의 철저한 조사에 관심이있는 연구자를위한 가장 적합합니다. 이 프로토콜은 이미 그들이 반복 쿼리에 관심이 관심의 50 ~ 500 유전자의 부분 집합에 (마이크로 어레이 또는 RNAseq 실험을 통해)에서 연마 한 연구자에 가장 적합합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
행동 패러다임 아래의 뇌 조직에서 유전자 발현의 성공적인 특성화에 따라 달라집니다 : 행동 패러다임 동안 마우스의 1) 취급에주의; 관심의 조직 2) 신속하고 정확한 해부; 3) RNA 안전 조치 RNA의 무결성을 보장하기 위해; 4)주의 프라이머 및 실험 레이아웃의 계획뿐만 아니라 qPCR에 분석을위한 준비 세부 사항에 대한 정밀도와 관심.
기재된 절차의 목적은 환경에 의해 유도 된…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been funded by the Israel Science Foundation Grant (ISF # 393/12), Israel Centers of Research Excellence Grant (I-CORE 1796/12), German-Israel Foundation Grant (GIF # 2299-2291.1/2011) and the Marie Curie Career Integration Grant (FP7-PEOPLE-2013-CIG #618201). Initial steps in the project were funded by an AXA postdoctoral fellowship to AC. We acknowledge the generous startup funds provided by the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences.
Critical reading by members of the Citri lab is greatly appreciated.
Materials
| Virusol | Oriek Medical | J29D | |
| Isoflurane, USP 100% | MINRAD INC | NDC 60307-110-25 | |
| RNeasy plus Universal Mini Kit | QIAGENE | 73404 | |
| QIAshredder | QIAGENE | 79654 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription kit | Invitrogene | AB-4368814 | |
| TE Buffer | Invitrogene | 1355656 | |
| Behaviour Chamber (MDF; 50X45cm) | Self assembled | ||
| Inner Perspex box (30X30cm) | Self assembled | ||
| camera and video recorder | Campden Inst | CMD-80051 | |
| Media Recorder software | Noldus | NDS-NMR3-00M | |
| Iris Scissors | FST | FST-14062-09 | |
| Sagital Brain slicer with a 0.5mm section | Brain Tree Scientific | BS-AL-505S | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | The Agilent 2100 Bioanalyzer | |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1852048 | |
| Inverted microspun spatula | Bochem Instrument GmbH | 3213 | |
| Biomark HD Reader | Fluidigm | BMHD-BMKHD | |
| Dynamic array Chip for 96.96gene expression | Fluidigm | BMK-M-96.96 |
References
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