High-throughput Analisi dei mammiferi olfattive Recettori: Misurazione del recettore Attivazione tramite Luciferase Activity

Il sistema olfattivo dei mammiferi ha la capacità di rispondere ad un vasto numero di stimoli odorosi, consentendo la rilevazione e la discriminazione di migliaia di odoranti. Recettori olfattivi (OR) sono i sensori molecolari espressi dai neuroni sensoriali olfattivi nell'epitelio olfattivo ^12. Riconoscimento odore dei mammiferi avviene attraverso l'attivazione differenziale delle RUP di odoranti, e l'OR famiglia di geni è ampia, con circa 1.000 murino e 400 recettori umani ^12-16. Analisi funzionali precedenti di RUP nei neuroni olfattivi e nelle cellule eterologhe hanno dimostrato che diversi odoranti sono riconosciuti da unico, ma insiemi di RUP ^10,17-20 sovrapposizione. Corrispondenza ligandi di RUP è fondamentale per comprendere il codice olfattivo ed essenziale per la costruzione di modelli sostenibili di olfatto. A causa delle difficoltà che esprimono RUP in sistemi eterologhi nonché il gran numero di entrambi odoranti e RUP, questi dati è stato praticamente assente dal field; anzi, meno del 6% delle RUP umani hanno un ligando pubblicato ^1-11. Questo protocollo descrive l'uso di un saggio di luciferasi per caratterizzare odoranti / o interazioni. Questo test consente la caratterizzazione high-throughput di RUP, un compito che è essenziale per comprendere odorizzante / o interazioni, nonché lo sviluppo di un modello di codifica odore.

Gli studi High-throughput di RUP devono affrontare tre grandi sfide. In primo luogo, OR espressi in cellule eterologhe sono stati mantenuti al pronto soccorso e successivamente degradata nel proteasoma ^21,22, impedendo ai RUP di interagire con odoranti nel sistema di dosaggio ^23-25. Questo problema è stato affrontato dalla scoperta di proteine ​​accessorie che facilitano l'espressione sulla superficie cellulare stabile di una vasta gamma di RUP ^19,26,27. Receptor-trasportatore-proteine ​​1 e 2 (RTP1 e 2) promuovere o espressione sulla superficie cellulare e l'attivazione in risposta alla stimolazione odorizzante ^19. Sulla base di questo lavoro, HEK293T cellule eranomodificata per esprimere stabilmente RTP1 lungo (RTP1L) e RTP2, recettore espressione di miglioramento proteina 1, e G _αolf, risultante nella linea cellulare Hana3A ^19,27. Inoltre, il tipo 3 recettori muscarinici (M3-R) interagisce con RUP sulla superficie cellulare e migliora l'attivazione in risposta a odoranti ^26. Co-trasfezione di un OR con RTP1S e M3-R in Hana3A cellule risultati nella robusta, coerente e funzionale espressione di una vasta gamma di RUP sulla superficie cellulare ^27. In secondo luogo, mammifero o repertori sono abbastanza grandi. Negli esseri umani, per esempio, il repertorio OR è un ordine di grandezza più numerose di repertorio recettore gustativo, e 2 ordini di grandezza più numerose di repertorio recettore visivo. Sebbene clonazione di una singola O è un protocollo relativamente semplice, è necessaria notevole sforzo up-front per generare una libreria completa. In terzo luogo, anche se sappiamo che nella visione, di lunghezza d'onda si traduce in colori ein frequenza audizione si traduce in campo, l'organizzazione degli odori è poco conosciuta, rendendo difficile per i ricercatori di interpolare da un campione rappresentativo di odoranti. Anche se sono stati compiuti alcuni progressi su questo fronte ^10,28, la mappa del paesaggio olfattivo rimane incompleto. Screening decine di migliaia di molecole contro centinaia di RUP è un compito arduo; schermi high-throughput in questo settore richiedono campagne accuratamente definiti. Le grandi sfide rimanenti sono quelli della logistica e dei costi, piuttosto che problemi inerenti alla tecnica. Sebbene lo screening eterologo non è stato ampiamente utilizzato per identificare ligandi da gruppi accademici, una società privata ha utilizzato la stessa tecnica per identificare ligandi per 100 RUP umani ^29. Purtroppo, questi dati rimangono di proprietà.

La luciferasi saggio ad alta prestazione qui descritto ha diversi vantaggi rispetto ai metodi alternativi utilizzati per valutare O attivazione. Anche se la responsabilitàses dei neuroni sensoriali olfattivi nativi sono stati misurati utilizzando elettrofisiologia e di imaging di calcio, queste tecniche hanno difficoltà a prendere in giro oltre che O porta alla risposta di un neurone causa della sovrapposizione di proprietà di risposta per i neuroni olfattivi. Anche se bussare in una GFP-etichettata tipo di recettore ^30,31, offrendo recettori specifici tramite adenovirus murino neuroni olfattivi ^32,33, o l'esecuzione di RT-PCR dopo le registrazioni ^17,24,33 può collegarsi registrazioni tipi di recettori singoli, questi metodi sono a bassa velocità e non adatto per schermi di grandi dimensioni. Sistemi di screening eterologhi sono più scalabili, e due forme principali si trovano in letteratura: i giornalisti di via cAMP e inositolo trifosfato (IP3) giornalisti di via. Dopo stimolazione odore, RUP attivano una cascata di segnali G _αolf trasduzione che provoca la produzione di AMP ciclico (cAMP) ^12. Mediante co-trasfezione una lucciola gene reporter luciferasi sotto il controllo di acAMP risposta elemento (CRE), produzione luciferasi può essere misurata in funzione della risposta odore, permettendo la quantificazione di OR attivazione. O attivazione può anche essere collegata al percorso IP3 mediante co-esprimono proteine ​​G come G _α15/16 o un G _α15-OLF chimera ^24,25,34. Abbiamo scelto il saggio qui presentato sulla base di tre fattori: (1) la co-espressione di RTP1 con i recettori olfattivi Rho-contrassegnate migliora l'espressione di recettori olfattivi sulla superficie cellulare ^19,27; (2) l'uso di un gene reporter cAMP-reattivo consente la misurazione di OR attivazione attraverso il percorso del secondo messaggero canonica; e (3) il saggio è adatto agli schermi high-throughput.

Questo saggio luciferasi ad alta produttività è applicabile ad una varietà di pregevoli studi al campo dell'olfatto. In primo luogo, un gran numero di RUP può essere proiettato contro un singolo odorante per determinare lo schema di attivazione recettore di un spodorizzante ecific. Questo tipo di studio ha identificato OR7D4 come OR responsabile per rispondere alla steroide androstenone odorizzante ^8. Viceversa, uno o potrà essere schermato contro un pannello di odoranti per determinare il profilo di risposta recettore ^10. Quando candidato olfattivo odorizzante / O coppie sono identificati tramite questi schermi, interazione può essere confermata effettuando un esperimento dose risposta esaminando la risposta del OR a concentrazioni crescenti di odorizzante. Curve dose-risposta possono anche valutare come variazione genetica in un OR colpisce in vitro risposta odorizzante ^8,9,11,35, e questi studi possono essere esteso a interspecifica o variazione, consentendo l'esame dell'evoluzione del recettore attraverso le specie e le mutazioni causali nell'evoluzione ^36,37, infine, questo saggio può essere utilizzato per lo screening di antagonisti odori che sono in grado di antagonizzare o la risposta ad una particolare odorizzante per una coppia odorizzante / ricevitore conosciuto ^38,39. In sintesi, questo alto-Capacità saggio luciferasi è applicabile ad una serie di studi che aiuteranno caratterizzano o pattern di attivazione e fornire una migliore comprensione della codifica odore nel sistema olfattivo.