تحليل الإنتاجية العالية من الثدييات شمي المستقبلات: قياس مستقبلات التنشيط عبر luciferase المراسل آخر

نظام حاسة الشم لدى الثدييات لديه القدرة على الرد على عدد كبير من المحفزات معطر، مما يسمح للكشف والتمييز الآلاف من عطر. المستقبلات الشمية (نسب الأرجحية) هي أجهزة الاستشعار الجزيئية التي أعرب عنها الخلايا العصبية الحسية الشمية في الظهارة الشمية ^12. يحدث الاعتراف رائحة الثدييات من خلال تفعيل الفرق من نسب الأرجحية التي كتبها عطر، والأسرة الجين أو واسعة النطاق، مع ما يقرب من 1،000 الفئران و 400 مستقبلات الإنسان ^12-16. وقد أظهرت التحليلات الفنية السابقة من نسب الأرجحية في الخلايا العصبية الشمية في الخلايا والتي مغاير عطر مختلفة معترف بها من قبل فريدة من نوعها، ولكن تداخل الفرق من نسب الأرجحية ^10،17-20. مطابقة لنسب الأرجحية بروابط أمر بالغ الأهمية لفهم رمز الشم وضرورية لبناء نماذج قابلة للتطبيق من الشم. بسبب صعوبات التعبير عن نسب الأرجحية في أنظمة مغايرة فضلا عن عدد كبير من كل من عطر ونسب الأرجحية، كانت غائبة إلى حد كبير هذه البيانات من ودرع؛ في الواقع، فإن أقل من 6٪ من نسب الأرجحية البشرية لديها يجند نشرت ^1-11. يصف هذا البروتوكول استخدام مقايسة luciferase المراسل لوصف الرائحة / أو التفاعلات. هذا الاختبار يمكن توصيف الإنتاجية العالية من أملاح الإماهة الفموية، وهي مهمة ضرورية لفهم الرائحة / أو التفاعلات وكذلك تطوير نموذج للرائحة الترميز.

تواجه الدراسات الإنتاجية العالية من نسب الأرجحية ثلاثة تحديات رئيسية. أولا، تم الإبقاء على نسب الأرجحية التي أعرب عنها في الخلايا مغاير في ER وتدهورت في وقت لاحق في proteasome ^و21،22، ومنع نسب الأرجحية من التفاعل مع عطر في نظام مقايسة ^23-25. وقد وجهت هذه المشكلة عن طريق اكتشاف البروتينات التي تسهل التبعي مستقرة التعبير سطح الخلية من مجموعة واسعة من نسب الأرجحية ^19،26،27. مستقبلات نقل البروتينات 1 و 2 (RTP1 و2) تعزيز أو التعبير سطح الخلية وتفعيل ردا على التحفيز الرائحة ^19. على أساس هذا العمل، وكانت الخلايا HEK293Tتعديل للتعبير ثابت RTP1 طويلة (RTP1L) وRTP2، مستقبلات البروتين تعزيز التعبير 1، وG _αolf، مما أدى إلى خط الخلية Hana3A ^19،27. بالإضافة إلى ذلك، نوع 3 المسكارينية مستقبلات الأستيل كولين (M3-R) يتفاعل مع نسب الأرجحية على سطح الخلية ويعزز التنشيط استجابة لعطر ^26. شارك في ترنسفكأيشن لأو مع RTP1S وM3-R في Hana3A خلايا النتائج في التعبير قوية ومتسقة وظيفية من مجموعة واسعة من نسب الأرجحية على سطح الخلية ^27. الثانية، الثدييات أو ذخيرة كبيرة جدا. في البشر، على سبيل المثال، مرجع أو هو أمر من حجم أكثر عددا من مستقبلات ذخيرة الذوقية، و 2 أوامر من حجم أكثر عددا من مستقبلات بصرية ذخيرة. على الرغم من أن استنساخ واحد أو هو بروتوكول بسيط نسبيا، مطلوب جهد مقدما كبيرة لإنشاء مكتبة شاملة. الثالث، على الرغم من أننا نعرف أن في الرؤية، والطول الموجي يترجم إلى لون وفي وتيرة الاختبار يترجم إلى الملعب، ومن المفهوم تنظيم الروائح سيئة، مما يجعل من الصعب على الباحثين أن أقحم من عينة تمثيلية من عطر. على الرغم من إحراز بعض التقدم على هذه الجبهة ^10،28، وخريطة المشهد حاسة الشم لا تزال غير مكتملة. فحص عشرات الآلاف من الجزيئات ضد المئات من نسب الأرجحية هي مهمة شاقة؛ تتطلب شاشات عالية الإنتاجية في هذا المجال حملات محددة بعناية. التحديات الرئيسية المتبقية هي تلك الخدمات اللوجستية والتكلفة بدلا من المشاكل الملازمة لهذه التقنية. على الرغم من أن الفحص مغاير لم يستخدم على نطاق واسع لتحديد بروابط من قبل الجماعات الأكاديمية، وقد استخدمت شركة خاصة نفس الأسلوب لتحديد بروابط نسب الأرجحية ل100 الإنسان ^29. للأسف، لا تزال هذه البيانات الشخصية.

مقايسة luciferase المراسل الإنتاجية العالية المذكورة هنا لديها العديد من المزايا أكثر من الطرق البديلة المستخدمة لتقييم أو التنشيط. على الرغم من أن المسؤولةوقد تم قياس سيس من الخلايا العصبية الحسية الشمية الأم باستخدام الكهربية والتصوير الكالسيوم، وهذه التقنيات يجدون صعوبة في إغاظة وبصرف النظر الذي يؤدي إلى استجابة أو الخلايا العصبية بسبب عدم التداخل في خصائص استجابة الخلايا العصبية لحاسة الشم. على الرغم من أن يطرق-في GFP المسمى نوع مستقبلات ^30،31، وتقديم مستقبلات معينة عبر اتش لالفئران الخلايا العصبية الشمية ^32،33، أو أداء RT-PCR بعد التسجيلات ^17،24،33 يمكن ربط تسجيلات لأنواع مستقبلات واحدة، وهذه الأساليب هي منخفضة الإنتاجية وغير مناسبة للشاشات واسعة النطاق. أنظمة الفحص مغايرة هي أكثر استيعابا، وتوجد شكلين رئيسيين في الأدب: مسار للصحفيين المخيم واينوزيتول ثلاثي الفوسفات (IP3) للصحفيين المسار. على التحفيز رائحة، نسب الأرجحية تنشيط إشارة تتالي تنبيغ G _αolf أن النتائج في إنتاج دوري امبير (المخيم) ^12. من قبل المشترك transfecting على يراعة luciferase مراسل الجينات تحت سيطرة ميلانAMP عنصر الاستجابة (لجنة المساواة العرقية)، ويمكن قياس إنتاج luciferase المراسل بوصفها وظيفة من استجابة رائحة، مما يسمح لتقدير حجم أو التنشيط. أو التنشيط ويمكن أيضا أن تكون مرتبطة مسار IP3 قبل المشترك، معربا عن G-البروتينات مثل G _α15/16 أو _{G-α15 جبهة تحرير أورومو} الوهم ^24،25،34. اخترناه مقايسة المقدمة هنا على أساس ثلاثة عوامل هي: (1) شارك في التعبير عن RTP1 مع المستقبلات الشمية رو الموسومة يحسن التعبير عن مستقبلات الشمية على سطح الخلية ^19،27؛ (2) استخدام الجينات مراسل المخيم تستجيب يسمح لقياس أو التنشيط من خلال الكنسي الثاني مسار رسول؛ و (3) الفحص هو مناسبة تماما لشاشات عالية الإنتاجية.

هذا luciferase الفحص الإنتاجية العالية هي التي تنطبق على مجموعة متنوعة من دراسات قيمة في مجال الشم. أولا، عدد كبير من نسب الأرجحية يمكن فحص ضد الرائحة واحد من أجل تحديد نمط تنشيط مستقبلات ليرة سوريةالرائحة ecific. هذا النوع من الدراسة تحديد OR7D4 كما OR ​​المسؤولة عن الاستجابة لandrostenone الرائحة الستيرويد ^8. على العكس، واحدة أو يمكن فحص ضد فريق من عطر من أجل تحديد ملف استجابة مستقبلات ^10. عندما يتم تحديد مرشح حاسة الشم الرائحة / أو أزواج عبر هذه الشاشات، ويمكن التأكد من التفاعل عن طريق إجراء تجربة الاستجابة للجرعة دراسة استجابة أو لتركيزات متزايدة من الرائحة. يمكن منحنيات الاستجابة للجرعة أيضا تقييم مدى الاختلاف الجيني في أو يؤثر في استجابة الرائحة المختبر ^{8،9،11،35،} ويمكن تمديد هذه الدراسات إلى الاختلاف بين الأنواع أو، مما يسمح لفحص تطور مستقبلات عبر الأنواع والطفرات المسببة في تطور ^36،37، وأخيرا، وهذا الفحص يمكن استخدامها للكشف عن مضادات الرائحة التي هي قادرة على استعداء أو ردا على الرائحة خاص لزوج الرائحة / مستقبلات المعروفة ^38،39. باختصار، هذا عالية-الإنتاجية luciferase الفحص ينطبق على مجموعة من الدراسات التي تساعد تميز أو أنماط التنشيط وتوفير فهم أفضل للرائحة الترميز في نظام حاسة الشم.