JoVE Journal > Engineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Ingénierie

Protonen-Transfer und Protein-Zustände Dynamics in Lichtempfindliche Proteine, die durch zeitaufgelöste Step-Scan Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie

Published: June 27, 2014
doi:
10.3791/51622
,
1Experimental Molecular Biophysics,Freie Universität Berlin

Summary

Key steps of protein function, in particular backbone conformational changes and proton transfer reactions, often take place in the microsecond to millisecond time scale. These dynamical processes can be studied by time-resolved step-scan Fourier-transform infrared spectroscopy, in particular for proteins whose function is triggered by light.

Abstract

Die Überwachung der Dynamik der Protonierung und Proteinrückgrat Konformationsänderungen während der Funktion eines Proteins ist ein wesentlicher Schritt zum Verständnis der Mechanismus. Protonierung und Konformationsänderungen auf die Schwingungsmuster von Aminosäureseitenketten der Peptidbindung bzw. die beide durch Infrarot (IR)-Differenzspektroskopie untersucht werden. Für Proteine, deren Funktion wiederholt und reproduzierbar sein, ausgelöst durch Licht, ist es möglich, Infrarot-Differenzspektren mit (Sub-) Mikrosekunden-Auflösung über einen breiten Spektralbereich mit der Step-Scan-Fourier-Transformations-Infrarot-Technik erhalten. Mit ~ 10 2 -10 3 Wiederholungen der Photoreaktion, die Mindestzahl einen Scan zu vernünftigen spektrale Auflösung und Bandbreite in Anspruch, kann der Geräuschpegel in der Absorptionsdifferenzspektren weniger als ~ 10 – 4, die ausreicht, um die Kinetik folgen Protonierung Änderungen einer einzelnen Aminosäure. UntereLärmpegel um mehr Datenmittelung und / oder mathematische Verarbeitung erreicht werden. Die Proteinmenge für optimale Ergebnisse erforderlich ist zwischen 5-100 &mgr; g, in Abhängigkeit von der Probenentnahme verwendet. Über zusätzliche Anforderungen, muss das Protein zunächst in einem Puffer niedriger Ionenstärke konzentriert und dann getrocknet, um einen Film zu bilden. Der Eiweißfilm wird vor dem Experiment hydratisiert, entweder mit kleinen Tröpfchen von Wasser oder unter kontrollierten atmosphärischen Feuchtigkeit. Der erreichte Grad an Feuchtigkeit (g Wasser / g Protein) aus einem IR-Absorptionsspektrum gemessen. Um die Technik zu präsentieren, untersuchten wir den Photo der lichtgetriebenen Protonenpumpe Bakteriorhodopsin in seiner nativen Purpurmembran Umwelt und des lichtgesteuerten Ionenkanal Channelrhodopsin-2 in Waschmittel gelöst.

Introduction

Um vollständig aufzuklären, wie Proteine ​​ihre Funktion zu erfüllen, ist es erforderlich, sie zu messen, wie sie funktionieren, dh entlang eines Reaktionsweges, der oft mit einer Reihe von Zwischenprodukten und erstreckt sich mehrere Aufträge der Zeit. Die wichtigsten Schritte der Proteinfunktion finden oft im Mikrosekunden-Zeitbereich bis 1 Millisekunde, insbesondere Rückgrat Konformationsänderungen und Protonentransfer-Reaktionen in Membranproteinen. Röntgenkristallographie, wohl die Säule der Strukturbiologie, stellt statische (zeitlich gemittelte) Elektronendichten aus gut beugenden Proteinkristallen, notorisch schwierig, mit Membranproteinen 2 wachsen. Ein 3D-Atommodell kann auf der Grundlage Elektronendichte gebaut werden, wenn auch selten, einschließlich der Lage der Wasserstoffatome. Bemerkenswerte Fortschritte bei der zeitaufgelösten Röntgenstrukturanalyse, die sich entweder auf Laue-Beugungs 3 oder auf Femtosekunden-Röntgenpulse 4, fügt die Zeitdimension des hohen Strukturinformationenrente zu Röntgenkristallographie 5. Aber abgesehen von technischen und analytischen Anforderungen kann die Kristallgittergerüst Konformationsänderungen beeinträchtigen und Proteindynamik, einen unvermeidbaren Nachteil von Verfahren, die auf Proteinkristallen 5 ändern. Folglich, dynamische Aspekte der Proteine ​​werden immer noch am besten mit optischen Methoden abgedeckt, wie Blitzphotolyse 6,7 Pionier, wenn auch mit der allgemeinen Nachteil der begrenzten strukturellen Einsicht.

Fourier-transformierten Infrarot-Spektroskopie (FT-IR) kombiniert die zeitliche Auflösung der optischen Spektroskopie mit einem wertvollen Empfindlichkeit auf Proteinstruktur, die letzte Funktion in unzähligen statischen Struktur-und Funktionsuntersuchungen an Membranproteinen 8-11 ausgebeutet. Insbesondere hat FT-IR-Differenzspektroskopie sich als ein ideales Werkzeug, um kleine spektralen Veränderungen als Protein Transite von einem metastabilen Zustand in einen anderen 12-19 studieren.

Studies auf Proteindynamik, außer auf der Einzelmolekülebene 20,21, erfordern einen Auslösevorgang für die Synchronisation. Eine Reaktion wird zweck schnell und nicht invasiv unter Verwendung von Licht als Trigger ausgelöst, wie in der Untersuchung von Proteinen mit cyclischen Photoreaktionen erfolgen. Eine große Herausforderung mit zeitaufgelöste Studien verbunden ist, ist das Erreichen von ausreichender Zeitauflösung während gute spektrale Auflösung und geeignete Signal-zu-Rausch-Verhältnis. Auch unerlässlich ist, um eine ausreichend breite spektralen und zeitlichen Bereich abdecken. Zeitaufgelösten Step-Scan-FT-IR-Spektroskopie zeichnet sich in allen diesen Aspekten 22, mit publizierten Beispiele für Spektralbereiche so breit wie 3,900-850 cm -1 und Dynamik verlauf ~ 9 Größen Zeit, mit bis zu 3,5 cm -1 spektral und 30 ns Zeitauflösung 23-28.

Fourier-Transformations-IR-Spektrometer zeigen, reduziertem Rauschen und verbesserte photometrische Genauigkeit über dispersive diejenigen 29. However in der normalen Schnellscan-Aufnahmemodus FT-IR-Spektrometer leiden unter einer Zeitauflösung auf ≥ 5-10 msec als Folge der minimalen Zeit die Mobil Spiegel des Interferometers benötigt, um eine Abtastung zu vervollständigen beschränkt. Mit der Step-Scan-Technik, im Gegensatz dazu die Zeitabhängigkeit der dynamischen Ereignisses aus der Scan-Dauer des Interferometers entkoppelt. Kurz gesagt, die mobilen Spiegel bewegt sich in diskreten Schritten statt kontinuierlich gescannt, um einen Scan abzuschließen. Bei jedem dieser Schritte die (mobile) Spiegel festgehalten wird und eine vorübergehende aufgezeichnet. Somit wird die Zeitauflösung durch die Anstiegszeit des Quecksilber-Cadmium-Tellurid (MCT)-Detektor, die in der Regel im Bereich von 10-100 Nanosekunden begrenzt. In der Praxis der große dynamische Bereich des Interferogramms (ein intensives Signal bei den Center und kleine Signale in den Flügeln enthält), benötigt für die richtige Digitalisierung eines Analog / Digital-Wandler (ADC) mit nicht weniger als 16-24 Bits, was zu einer Probenahme Raten nicht höher als ~ 200 kHz(5 Mikrosekunden) 30. Nanosekunden-Auflösung kann durch die Messung der Änderungen in dem Interferogramm, für die ein Bit ADC 8-12 reicht 23,31-33 erreicht werden. Technische Aspekte 30,34,35 und Anwendungen 36-38 der zeitaufgelösten Step-Scan im Detail an anderer Stelle diskutiert.

Der Zweck der Strombeitrag ist ein Protokoll zur Beschreibung der praktischen Aspekte der zeitaufgelösten Step-Scan-FT-IR-Spektroskopie auf der lichtempfindlichen Membranproteine ​​bereitzustellen. Übertragung und abgeschwächte Totalreflexion (ATR): Hier wird die Leistung der Technik für zwei Stichprobenverfahren gezeigt. Die Verwendung von ATR ermöglicht in Gegenwart von überschüssigem Wasser, das nicht nur für vollständige Hydratation Bedingungen für das Protein, sondern ermöglicht auch akute Steuerung des Proben-pH und Ionenstärke 49,50 arbeitet. Bakteriorhodopsin und Channelrhodopsin-2: Step-Scan-Experimente werden auf zwei ausgewählte Systeme veranschaulicht.

<p class="jove_content"> Die lichtgetriebene Protonenpumpe Bakteriorhodopsin (bR) ist seit über 40 Jahre 39,40 Gegenstand von zahlreichen biophysikalischen Studien, so dass es das am besten verstanden Membranprotein so weit. Unter den zahlreichen Techniken, um die Untersuchung der Funktionalität bR FT-IR-Spektroskopie angewendet ausgeübt hat wohl einer der größten Auswirkungen. Das heißt, hat FT-IR-Spektroskopie war der Schlüssel, um die Gruppen in der Protonentransfer durch die Membran beteiligt, wie an anderer Stelle 13,41,51 entfielen lösen.

Channelrhodopsin (ChR) ist das erste lichtgesteuerten Ionenkanal in der Natur 42,43 gefunden. Lichtanregung von Chr. führt zur vorübergehenden Öffnung eines Ionenkanals. Seine Entdeckung ließ sich der Weg für die Entwicklung der Optogenetik, wo molekularen Prozesse werden durch Licht gesteuert 44,45. ChR gehört, Br, zur Familie der mikrobiellen Rhodopsinen aber im Gegensatz zu bR, viel weniger ist über seine Funktionsmechanismus 52 bekannt. ChR2 kombiniert seine Funktion als ion-Kanal mit Protonenpumpaktivität 46,47. Vor kurzem gelang zeitaufgelöste Step-Scan FT-IR-Spektroskopie, um intra-Protein-Protonen-Transfer-Reaktionen und die Dynamik der Proteinrückgrat Konformationsänderungen in ChR2 48 zu lösen.

Protocol

1. Allgemeine Aspekte der Proben-und Instrumentenaufbereitung Einen kommerziellen FT-IR-Spektrometer für die zeitaufgelöste Step-Scan-Messungen ausgestattet. Für beste Ergebnisse legen die FT-IR-Spektrometers auf einem schwingungsentkoppelt Tabelle. Evakuieren Sie den Optikraum zu einigen mbar. Spülen Sie die Probenkammer mit trockener Luft oder Stickstoff. Platzieren eines IR-transparenten Material undurchlässig für sichtbare Strahlung vor dem MCT-Detektor des FT-IR-Spektrometer. Diese Vorsichtsmaßnahme ist wichtig, um Artefakte aus der anregenden Laserimpuls während Step-Scan-Experimente zu verhindern. Anmerkung: Wir verwenden ein Germanium (Ge)-Fenster von 25 mm Durchmesser. Der hohe Brechungsindex führt zu unerwünschten Intensität verliert, mit einem Ge-Filter mit antireflektierenden Beschichtung weitgehend vermieden. Kühlen Sie den MCT-Detektor Dewar mit flüssigem Stickstoff. Anmerkung: Die Verwendung von Photovoltaik-MCT-Detektoren über photoconductives wegen ihrer linearen Reaktion bevorzugt, und somit überlegene photometric Genauigkeit und Zuverlässigkeit Basis 31,53. Vorkonzentrat die Probe für die Experimente mindestens 2 mg Protein / ml in einem Puffer von niedrig (<20 mM) Ionenstärke, um die Bildung von Salzkristallen zu verhindern, während dem Trocknen der Proteinsuspension, um eine homogene Proteinfilm zu bilden. Bei Proben, sedimentieren, waschen / zu konzentrieren, indem sie Ultrazentrifugation (zB Membranproteine ​​in einem Liposomen oder in der Zellmembran Patches). Verwenden centricons der richtigen Grenz für Proteine, die das nicht tun Sediment (z. B. Reinigungsmittel gelösten Membranproteine). Für optimale Ergebnisse Einsatz: a) Proteinpräparate so rein und aktiv wie möglich; b) Lipid / Protein-Verhältnissen ≤ 3 in Gewicht für Proteine ​​in der Zellmembran Patches oder in Liposomen rekonstituiert; c) Detergens / Protein-Verhältnissen ≤ 1 in Gewicht für Reinigungsmittel solubilisiert Proteine. Vermeiden Sie den Einsatz von Wasch-oder Lipide, deren Schwingungsbanden überschneiden sich mit denen des Proteins (z. B. CHAPS). </ol> 2. Vorbereitung der ATR-Experimente an Bakteriorhodopsin Montieren Sie den ATR-Zubehör in den Probenraum des FT-IR-Spektrometer. Hinweis: Wir verwenden eine ZnSe / Diamant-ATR mit 5 aktiven Reflexionen. Vermeiden Halbleitermaterialien, wie Germanium oder Silizium als interne Reflexionselement (IRE) des ATR-Zubehör, deren optische Eigenschaften von der Erreger sichtbare Laser betroffen. Messen Sie eine breite Palette (ca. 4,000-800 cm -1) Energiespektrum bei 4 cm -1 Auflösung des Rein IRE Oberfläche mit herkömmlichen Rapid-Scan-FT-IR-Spektroskopie. Verwenden dieses Spektrum als Referenzspektrum zu Absorptionsspektren zu einem späteren Zeitpunkt zu berechnen. Decken den IRE Oberfläche des ATR mit 20 ul des Puffers später verwendet, um die Probe (beispielsweise 4 M NaCl und 100 mM NaPi pH 7,4) zu rehydrieren. Messung der IR-Absorption des Puffers. Entfernen Sie den Puffer, und spülen Sie die Oberfläche IRE with Wasser. Berühren Sie nicht die Oberfläche. Flüssigkeitsreste aus der IRE-Oberfläche durch eine intensive Luftstrom. Verbreiten ~ 3 ul von Bakteriorhodopsin (bR) in Purpurmembranen (~ 6 mg Protein / ml in VE-Wasser) auf der Oberfläche IRE (~ 0,2 cm 2-Bereich). Trocknen Sie die Proteinsuspension unter einem leichten Strom von trockener Luft, bis ein Film erreicht wird. Messen des Absorptionsspektrums des trockenen Films (siehe Fig. 1). Hinzufügen sanft 20-40 ul eines Puffers mit hoher Ionenstärke, um den Trockenfilm (beispielsweise 4 M NaCl und 100 mM NaPi pH 7,4) zu rehydrieren. Anmerkung: Die hohe Ionenstärke verhindert eine übermäßige Quellung der Membranfolie, so dass so viel Protein wie möglich nahe an der abgetasteten Fläche (Fig. 2) zu halten. Decken Sie die ATR Halter mit Deckel, um die Wasserverdunstung zu verhindern. Optional legen Sie ein Deckmantel, um einen Kreislauf Bad auf 25 ° C für die Temperaturregelung eingerichtet ist. Für Proteine ​​mit langen Photozyklen (& #62; Sekunden), können Temperaturregelung Basislinienstabilität zu erhöhen. Messen Sie ein Absorptionsspektrum. Schätzung des Prozentsatzes der Probe nahe der Oberfläche verbleibt, nachdem der Rehydratisierung des Films durch Subtrahieren des Absorptionsspektrums des Puffers (Fig. 3). Bestätigen Stabilisierung der Filmquell durch Aufzeichnen Absorptionsspektren: 5-20 min Intervallen nach der Rehydratation (Abbildung 4). Dieser Schritt ist optional, wird aber empfohlen. 3. Darstellende Transmission Experimente an gelöstem Waschmittel Channelrhodopsin-2 Werden 10 ul ChR2 (~ 10 mg Protein / ml) in 5 mM NaCl, 5 mM HEPES (pH 7,4) und Decyl-maltosid (DM) in der Mitte eines BaF 2-Fenster von 20 mm Durchmesser gelöst. Verteilt sie mit Hilfe der Mikropipettenspitze mit einem Durchmesser von 6-8 mm (Protein-Oberflächendichte von ~ 200 &mgr; g / cm 2). Einen Film using einen sanften Fluss der trockenen Luft. Für die besten Ergebnisse zu gewährleisten, dass der Film homogen ist und einen Durchmesser etwa entsprechend der Größe des IR-Strahls in der größten Öffnung. Hydrat der Film durch Hinzufügen von 3-5 ul einer Mischung aus Glycerin / Wasser in 3-5 verteilt Tropfen um dem trockenen Film, und dicht schließen Sie es mit einem zweiten Fenster mit einem flachen Silikon-O-Ring von ≥ 1 mm Dicke. Hinweis: Das Verhältnis der Glycerin / Wasser-Mischung steuert die relative Feuchtigkeit zwischen den Fenstern 54. Für hygroskopische Proben mit einem 7.3 oder 8.2 Glycerin / Wasser-Verhältnis (w / w). Die Glycerin / Wasser fällt niemals in direkten Kontakt mit der Proteinfilm sein. Legen Sie die BaF 2 Fenster eingeklemmt in einer Halterung. Verhindern geraden Licht den Detektor erreicht, indem die Probe mit einem IR-Fenster opaken Material, wie Papier, mit einem Loch entsprechend der Größe des hydratisierten Films. Die Halterung im Probenraum. Steuerung der Temperatur des Halters 25 °C durch ein Thermostatmantel auf eine Temperatur gesteuerte Kreislauf-Bad verbunden. Messen Sie ein Absorptionsspektrum. Sicherzustellen, dass die maximale Absorption in dem Amid-I-Bereich (~ 1,700-1,620 cm -1) im Bereich von 0,6-1,0. Schätzung der Masse und molares Verhältnis von Protein / Detergens / Wasser aus dem Absorptionsspektrum des hydratisierten Films (Fig. 5) unter Verwendung von Referenzspektren Extinktionskoeffizienten für Wasser, DM, und repräsentative Membranproteine ​​(Abbildung 6). Warten, bis der Wasserhaushalt, bevor Step-Scan-Experimente (≥ 1 Std.) stabilisiert. 4. Einstellung und Synchronisation des anregenden Laser Für Versuche auf bR verwenden die zweite Harmonische Emission eines gepulsten Nd: YAG-Laser (λ = 532 nm), um die Photo auslösen. Für Experimente mit ChR2, verwenden Sie eine Anregung von λ = 450 nm, wie durch einen Operations bereitgestellt: YAG-Laser optischen parametrischen Oszillator (OPO) mit der dritten Harmonischen (λ = 355 nm) eines Nd angetrieben. Sicherzustellen, dass der Laserpuls kurz genug ist (~ 10 ns) zur sekundären Photoanregung zu minimieren. Hinweis: Die Energie der Laserimpulse so konstant wie möglich sein. In unserem Aufbau schwankt die Laserintensität ≤ 10% um den Mittelwert, wie durch Messen einer Reflex des Lasers durch eine Fotodiode auf einen Transientenrekorder verbunden und Integrieren der Reaktion (8) bestätigt. Paar den Laser auf die Probe. Einstellen der Energiedichte des Lasers bei der Probe 2-3 mJ / cm 2 pro Impuls mit einem Leistungsmesser. Für die ATR-Setup, verwenden Sie eine optische Faser oben auf der ATR Deckel platziert. Versuche zur Übertragung Spiegel verwenden, um den Laser auf die Probe zu bringen und, falls erforderlich, Linsen entweder kollimieren oder divergieren den Laserstrahl auf einen Durchmesser, der etwas oberhalb des Probenfilms groß. Synchronisieren Sie die laser mit Datenaufzeichnungsimpuls von dem Spektrometer. Verwenden des Q-Switch-Sync-Out-TTL-Impuls von der Elektronik des Nd: YAG-Laser, um das Spektrometer zu triggern. Stellen Sie die Anregungsfrequenz der Nd: YAG-Laser zu 10 Hz für Br und 0,25 Hz ChR2 sind. Verwenden eine Impulsverzögerungsgenerator (PDG), um die Laseranregungsrate zu steuern, wenn die Wiederholungsrate des Nd: YAG-Laser ist nicht leicht einstellbar. Verbinden der Lampe sync-out des Nd: YAG Lasers auf die PDG externen Triggereingang. Der PDG ein ~ 190 &mgr; s verzögert TTL Impulsausgang an den Q-Switch-Sync-In-Eingang des Nd: YAG-Laser, die Laser auslösen. Gate das PDG einen externen Trigger nur nach bestimmten Zeitdauer seit der letzten akzeptierten Auslöser (100 ms für Br oder 4 sec für ChR2) akzeptieren. 5. Zeitaufgelöste Step-Scan-Vorbereitungen und Einstellungen Platzieren eines optischen Tiefpassfilter in dem optischen Weg. Zeitaufgelöste Step-Scan-Messungen in der durch 1,800-850 cm -1 Spektralbereich, einen Filter verwenden, opak über 1950 cm -1 und mit guter Transmission (> 50-80%) unter 1800 cm -1 (Abbildung 7). Ändern des Detektors von AC auf DC-gekoppelten Modus. Hinweis: Nach der Einstellung der Interferogrammsignals nicht mehr um den Nullpunkt, sondern um einen Wert wie der DC-Ebene bekannt zu schwingen. Verwenden die größtmögliche Strahlöffnung des Spektrometers für höhere Photonenstrom und damit ein besseres Signal-zu-Rauschen, jedoch innerhalb der Grenzen der Linearität des Detektors. Bringen Sie den DC-Ebene des Interferogramms auf Null und justieren die elektronische Verstärkung, um eine bessere Nutzung der Dynamikbereich des Analog-Digital-konvertierten (ADC) zu machen. Erreichen DC-Pegel durch Anlegen einer Vorspannung an die von dem Vorverstärker vorgesehen Signals versetzt. Hinweis: Diese Option wird in der modernen FT-IR-Spektrometer aufgenommen. Andernfalls kann eine hausgemachte externen Gerät stattdessen verwendet werden, zwischen dem Vorverstärker und dem ADC 38 platziert. Care ist dannerforderlich, um sicherzustellen, dass die Elektronik einer solchen Vorrichtung schnell und linear. Starten Sie die Step-Scan-Menü des FT-IR-Spektrometer. Das Ziel gesetzt spektralen Bandbreite für die Step-Scan-Messung 1,975.3-0 cm -1. Einstellen der spektralen Bandbreite, die einem Bruchteil der Laserwellenzahl He-Ne-(1/8 th im vorliegenden Fall), die Grenz des optischen Filters geringfügig übersteigt. Deaktivieren Sie alle High-Pass-Filter, um elektronische Verzerrungen der Kinetik zu späteren Zeiten zu verhindern. Ein Tiefpassfilter elektronischen vorteilhaft sein kann, wenn ihre Grenzfrequenz in der Größenordnung oder oberhalb der Abtastrate des ADC (reduziert Rauschen Aliasing). Stellen Sie die Spektral-und Phasenauflösung bis 8 cm -1 und 64 cm -1. Stellen Sie den Erfassungsmodus Interferogramm zu einseitig nach vorne. Mit diesen Optionen ein Interferogramm benötigt etwa 500 Punkte. Die Abtastrate des ADC auf die höchste im Spektrometer (z. B. 160 kHzz oder 6,25 Mikrosekunden). Stellen Sie die "Auslöser für Experiment" auf "External", dh der Laser ist der Meister. Die Anzahl der linear ausgerichteten Datenpunkte aufgezeichnet werden: 7000 für bR (bis zu 42 ms) und 20.000 für ChR2 (bis 125 ms). Hinweis: Längere Zeitskalen ohne Überlaufen des ADC-Speicher unter Verwendung eines quasi-logarithmisch zeitlich beabstandeten externen TTL-Impulse von einem Wellengenerator zur Datenerfassung 38 auslösen abgedeckt werden, oder durch Verwendung von zwei parallel Transientenrekorder als Ersatz des internen ADC 31, 32. Sparen Sie ca. 100 Pre-Trigger-Punkte als Referenz für den dunklen Zustand der Probe. Anmerkung: In der Millisekunden-Zeitskala die Datenqualität häufig durch Schwankungen des mobilen Spiegels begrenzt. Erhöhen des vor dem Triggerpunkte oberhalb 100 wird daher nicht erwartet, dass die Datenqualität deutlich verbessern. Stellen Sie die Anzahl der Ko-Ergänzungen, dh, die Anzahl der Durchschnittswerte der Photoreaktion pro Spiegel postulierenion. Für bR, verwenden Sie 20 Co-Ergänzungen (20 min Messzeit bei 10 Hz Anregungsrate). Für ChR2 verwenden 2 Co-Ergänzungen (70 min Messzeit bei 0,25 Hz Erregerfrequenz) Wiederholen Sie das Experiment für bR 10x, 35x und auf drei verschiedenen Probenfilme für ChR2, um schließlich ~ 200 Co-Additionen pro Spiegelposition zu haben. 6. Data Processing Bestätigen den Status der Probe durch Vergleichen der lichtinduzierten IR-Differenzspektrum von der ersten und der letzten Messung erhalten. Sehen verwirft alle Messungen, bei denen die Intensität des Differenzspektrums unter 60% der ersten Messung. Durchschnittlich die aufgenommenen Interferogrammen. Mit dem OPUS-Software von der FTIR-Spektrometer wählen Sie die zeitaufgelöste Interferogramme gemittelt und fügen Sie sie der "Spectrum Rechner". Auf "=", um den Durchschnitt der Interferogramme zu erhalten. Hinweis: Wenn die Phase des Interferogrammsist während der Messung ist es gleichgültig durchschnittliche Interferogramme oder Single-Channel-Spektren ist konstant. Eine konstante Phase kann durch Berechnen und Vergleichen der Phasenspektrum für die erste und die letzte aufgezeichnete Interferogramm bestätigt werden. Die Fourier-Transformation der gemittelten Zeitaufgelöste Interferogramme gemittelt zeitaufgelösten Einzelkanal-Spektren zu erhalten. Mit der gleichen Software wie in Schritt 6.2.1, wählen Sie die gemittelte zeitaufgelöste Interferogramm und klicken Sie auf das Symbol für "Interferogramm Spektren". Verwenden Sie den Mertz-Phasenkorrektur-Verfahren, eine Null-Füllfaktor von 2 (zwei Punkte pro Instrumental digitale Auflösung) und einen Apodisierungsfunktion (zB Dreieck, Blackmann-Harris 3-Bedingungen, etc.). Klicken Sie auf die unten "umwandeln", um die zeitaufgelöste Interferogramm in zeitaufgelöste Spektren zu verwandeln. Exportieren Sie die zeitaufgelöste Einzelkanaldaten als "Datenpunkttabelle" oder ein "; Matlab "-Datei mit der" Speichern unter "-Symbol in der OPUS-Software. Weiterhin die Datenverarbeitung in einem externen Programm. Der Mittelwert der einzelnen Kanal-Spektren vor der Laser und die zeitaufgelöste Einzelkanaldaten zeitaufgelöster Absorptionsdifferenzspektren zu konvertieren. Berechnen Sie einen Vektor für die erwartete Lärmstandardabweichung der Differenzspektren als Funktion der Wellenzahl (Abbildung 12), mit der Rauschstandardabweichung, ε, und meine, S 0 (ν), der 100 Einzelkanal-Spektren vor der Laser: ε / S 0 (ν). Der Wert von ε wird geschätzt, Subtraktion aufeinanderfolgenden Einzelkanal-Spektren und die Berechnung der Standardabweichung durch √ 2 behoben. Entfernen Spektralbereiche zu laut, um von Nutzen sein (z. B. oberhalb von 1.825 cm -1 und unter 850 cm -1). Durchführen einer quasi-logarithmisch Lung (z. B. 20 Spektren / Zeitdekade). Die appearance der Daten zu verbessern und die Anzahl der Spektren von ~ 10 4 ~ 10 2 reduziert werden, ohne wesentliche Informationen verloren gehen (Fig. 9). Steigern Sie viermal die spektrale Dichte der Punkte (1 Punkt / cm -1) mit Fourier-Interpolation (Post Null-Füllung). Hinweis: Wir führen Sie die Schritte 6.4.1 bis 6.4.4 in einer hausgemachten Programm in MATLAB läuft. Verarbeiten Sie die erhaltenen zeitaufgelösten Spektren (Abbildung 10A) mit Einzelwertzerlegung SVD (Abbildung 13). Voll Daten Entrauschen durch Rekonstruktion der Daten mit einer begrenzten Anzahl von signifikanten SVD Komponenten (Fig. 10B). Hinweis: Wir führen SVD in MATLAB, mit der integrierten Funktion "SVD".

Representative Results

Figur 1 zeigt ein Absorptionsspektrum eines trockenen Films von bR auf der Oberfläche des Diamanten Innenreflexionselement für ATR-Spektroskopie abgeschieden. Charakteristische Banden von Schwingungen der Peptid-Bindung (Amid A, Amid-I-und Amid II) deutlich unterscheidbar sind. Die ungefähre Dicke der trockenen Folie als ~ 1 &mgr; m geschätzt werden (~ 0,2 cm 2) unter Berücksichtigung der Menge an zugesetztem Protein (18 ug) und die Oberfläche des ATR, und wobei die Dichte des Proteins als ~ 1,4 g / cm 3, 58 und der Lipide als 1,0 g / cm 3, 59 und einem Lipid / Protein-Verhältnis von 1/3 (w / w) in der Purpurmembran 60. Der trockene Film wurde mit einem Überschuß von 4 M NaCl, 100 mM NaPi pH 7,4 (Fig. 3) rehydratisiert. Der Grad an Feuchtigkeit und effektive Proteinkonzentration im Volumen von der abklingenden Welle sondiert kann von der Skalierungsfaktor benötigt abgeleitet werden, um digital zu entfernen Absorptionsbandenaus dem Wasser. Der optimale Skalierungsfaktor betrug 0,87, was bedeutet, dass in diesem Fall der Puffer belegt 87% und die Probe 13% des Volumens in der Nähe der Oberfläche. Unter Berücksichtigung der Protein-und Lipiddichte und der Lipid / Protein-Verhältnis in Purpurmembranen (siehe oben), können wir eine effektive Proteinkonzentration von 125 mg / ml im Volumen von der abklingenden Welle untersucht abzuleiten. Wir können aus der Hydrationsgrad, der in diesem besonderen Fall die Probe Filmdicke ~ 6 mal bei Rehydration erweitert, von ca. 1 bis ca. 6 &mgr; m abzuleiten. Für 45 ° Einfallswinkel, typisch für die meisten unserer und ATR Anordnungen variiert die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes (d p) für einen hydratisierten Proteinfilm zwischen 0,3 und 0,6 &mgr; m in der 1,800-850 cm -1 Intervall 61. Da das evaneszente Feld nahezu unempfindlich gegenüber der Probe zweimal über d p 61, folgern wir, daß die Menge des Proteins in der ATR Experiment verwendet im Prinzip reduziert werden 5x whne eine signifikante Signalverlust. Bei Verwendung von Puffern mit niedriger Ionenstärke der Folie ausdehnt, und die Menge des Proteins in dem Volumen durch das evaneszente Feld abgetastet wird verringert (Fig. 2). Die genaue Abhängigkeit zwischen Film Schwellung und die Ionenstärke des Puffers hängt unter anderem von der Art der Lipide. Zum Beispiel wurde eine ähnliche Filmquell wie hier für bR in Purpurmembran unter Verwendung von 4 M NaCl erhalten für ein Membranprotein in E. polaren rekonstituiert erhalten coli Lipide mit nur 0,1 M NaCl 62. Wenn die Probe weniger als 5% der angetasteten Volumen einnimmt betrachten erneut tut das Hydrationsschritt unter Verwendung eines Puffers höherer Ionenstärke. Filmquell nach der Hydratation einige Zeit benötigt, um eine Stabilisierung (Fig. 4) zu erreichen. BR in Purpurmembran das Verfahren monoexpotentielles, mit einer Zeitkonstante von 12 Minuten: es dauert nicht mehr als 30-60 Minuten, um einen stabilen Film haben rehydratisiert <pclass > Fig. 5 zeigt ein IR-Absorptionsspektrum eines hydratisierten Film der ChR2 durch Übertragung erhalten. Hier wurde Hydratation durch Aussetzen des trockenen Films einer Atmosphäre mit kontrollierter Feuchtigkeit durch eine Mischung aus Glycerin / Wasser vorgesehen erreicht. Das Spektrum kann in Beiträge aus Wasser, Reinigungsmittel und Protein zerlegt werden. Wir konnten die Menge von jedem von ihnen mit Extinktionskoeffizienten Spektren zu schätzen, skaliert, um die experimentellen Spektrum passen. Für Wasser haben wir den Extinktionskoeffizienten Spektrum aus der Literatur 63 und für DM maßen wir es von einer 100 mg / ml Lösung (6). Die mitochondriale ADP / ATP Träger 64 und BR (Fig. 7): Wir haben auch für zwei repräsentative Membranproteinen verwendet Extinktionskoeffizienten. Der Skalierungsfaktor gibt einen Wasser und DM flächenbezogene Masse von 260 g / cm 2 und 200 &mgr; g / cm 2 in dem Film auf. Die verbleibende Absorption (FigurE 5, rote Linie) kommt hauptsächlich von dem Protein, geschätzt bei einer Oberflächendichte von 250 g / cm 2 unter Verwendung des Amids II Extinktionskoeffizienten von zwei unterschiedlichen Membranproteinen (siehe Abbildung 6). Das molare Verhältnis für Protein / Detergens / Wasser wurde berechnet, 1/60/2000 mit einer Molekularmasse von 35 kDa, 480 Da und 18 Da betragen. Eine 3D-Darstellung von typischen zeitaufgelösten Step-Scan FT-IR-Experiment an bR ist in Abbildung 10A dargestellt, durch ATR gewonnen und mit 200 min der Datenerfassung. Spektren können zu bestimmten Zeitpunkten entnommen werden, beispielsweise wenn der L, M und N Zwischenprodukte der bR Photo sollen ihre höchste Population (11) zu erreichen. Die spektralen Eigenschaften haben ausführlich 13,41,65 beschrieben und werden hier nicht weiter diskutiert werden worden. Abbildung 12 zeigt Zeit-Spuren an einigen ausgewählten Wellenzahlen. Das heißt, der Anstieg der Kinetik bei 1762 cm -1 (t 1/2 ~ 60 Mikrosekunden) berichtet, auf die Dynamik der Asp85 Protonierung von der Retinal-Schiff-Base 66, und seine Zerfalls auf Null zeigt an, seine Deprotonierung auf Boden leichen Recovery 67. Der negative Anstieg der Kinetik bei 1.740 cm -1 (t 1/2 ~ 1 ms) berichtet über die Deprotonierung Asp96-Seitenkette, der Protonendonator an die Schiff-Base-68. Das Abklingen der Intensität Null Berichte über die Reprotonierung 67 aus dem Cytoplasma. Die Dynamik von Protein Konformationsänderungen durch Absorptionsänderungen in der Amid-I-und Amid-II-Region, die eine maximale Änderung in ~ 3 ms bei Raumtemperatur 67,69 erreicht sondiert werden. Die Anwendung der SVD, um Probleme hat vor spektroskopischen 55,56 bewertet. Kurz gesagt, SVD faktorisiert die experimentellen Daten, in eine Matrix A angeordnet, wie: A = U S <strong> V T. Diese Faktorisierung kann modifiziert werden, um die Rauschwellenzahlabhängigkeit zu berücksichtigen und Schwankungen / Driften der Grundlinie 57 zu bestrafen. Die Spalten von U und V enthalten Orthonormalspektren und Zeitspuren Vektoren für jeden SVD-Komponente auf. S ist eine diagonale Matrix, die die sogenannten Singulärwerte. Die (abstrakte) spektral-temporalen Komponenten in U-und V in abnehmender Bedeutung, um die experimentellen Daten im Sinne der kleinsten Quadrate, die durch ihre zugehörigen Einzelwert quantifiziert beschreiben angezeigt. 13A zeigt die Einzelwerte in Abhängigkeit von der Bauteilnummer und gibt die ersten acht Spalten / Komponenten von U (abstrakte Spektren, 13B) und V (abstrakte Zeit-Spuren, 13C). Das Signal in den ersten fünf Komponenten konzentriert wird (wie bei einem pH-Wert erwartetotocycle mit fünf Zwischenzustände), mit oben genannten Komponenten weitgehend durch Rauschen und andere Fehlerquellen dominiert. Die experimentellen Daten rekonstruiert unter Verwendung nur der ersten fünf Spalten von U und V, und die ersten fünf Spalten und Zeilen von S. Die von SVD rekonstruierten Daten stellt die beste Näherung der kleinsten Quadrate der experimentellen Daten an eine Matrix vom Rang fünf. Die rekonstruierten Daten zeigt eine verbesserte Qualität (10B). Insbesondere wird das Rauschen stark verringert, sowie einige kaum merkliche Schwankungen und Driften der Grundlinie (häufig in der zeitaufgelösten Spektroskopie Step-Scan-25). SVD Verarbeitung ist besonders vorteilhaft für die Verbesserung der Qualität der experimentellen Zeit-Spuren im Millisekunden-Bereich (rote Linien in Abbildung 12). Zeitaufgelösten Step-Scan-Daten für die ChR2 Photo wurden unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls zur Übertragung erhalten sion Experimente (Abbildung 14A), mit rund 120 Stunden der aufgelaufenen Messungen. Die zeitaufgelöste Daten durch Step-Scan gesammelt erstreckt sich von 6,25 &mgr; s bis 125 ms. Die Photo von ChR2 benötigt ca. 60 s für die vollständige Genesung. Die neueste Teil der Photo können mit Rapid-Scan FT-IR abgedeckt werden, und beide Step-Scan-und Rapid-Scan-Datensätzen zusammengeführt wie an anderer Stelle 48 vorgestellt. Die spektralen Veränderungen der ChR2 sind ~ 10-fach kleiner als die von bR erhalten, so dass die Messungen schwieriger. Speziell, Schwingungen in der Baseline im Millisekunden-Bereich werden bei diesen niedrigen Absorptionsänderungen deutlich zu erkennen. Diese sind aufgrund der kleinen Schwingungen in der mobilen Spiegel in der 25-Millisekunden-Zeitskala. Die Schwingungen, zusammen mit einem Teil des Rauschens, weitgehend von SVD entfernt werden, die Darstellung der Daten (14B) merklich verbessert. gure 1 "fo: content-width =" 5in "src =" / files/ftp_upload/51622/51622fig1highres.jpg "width =" 500 "/> Abbildung 1. Absorptionsspektrum von bR in Purpurmembran auf der Diamantoberfläche eines ATR-Zubehör getrocknet. Bands aus Schwingungen der Peptidbindung (Amid-I-, II und A) angegeben. 2. Absorptionsspektrum eines Films, der bR nach Rehydratisierung unter Verwendung von Puffern unterschiedlicher Ionenstärken (Verdünnungen von 4 M NaCl, 100 mM Na 2 HPO 4 / NaH 2 PO 4 bei pH-Wert 7,4). Beachte die Abnahme der Amid II-Band, dh erhöhte Film Schwellungen, mit abnehmender Ionenstärke des Puffers. (Insert) Relative Menge des Proteins in der Nähe der Oberfläche, durch die Intensität der Absorption bei 1.541 cm -1 (Amid-II-Maximum) nach Subtracti quantifiziertauf der Absorptions Beitrag des Puffers. 3. Absorptionsspektrum eines Films, der mit Schüttgut bR-Puffer (4,3 M Ionenstärke) und nach Subtraktion des Puffer Beitrag rehydratisiert. Die Subtraktion Faktor 0,87, wurde gewählt, um die starke Wasseraufnahme zwischen 3,700-3,000 cm -1 zu entfernen und um einen flachen Basislinie zwischen 2,700-1,800 cm -1 erhalten. 4. Absorptionsspektrum bR nach der Rehydratisierung mit einem Puffer von 4,3 M Ionenstärke (Puffer Absorption der Klarheit halber in Fig. 3 subtrahiert). Das Insert zeigt die Entwicklung des Filmquell nach rehydratIonen, die durch das Protein Amid-II-Absorption bei 1.541 cm -1 verfolgt. Eine Anpassung an einen einzelnen zeigt eine exponentielle Zeitkonstante für Filmquell Stabilisierung von 12 min. Abbildung 5. Absorptionsspektrum eines hydratisierten Film ChR2 durch Übertragungs (blaue Linie) gemessen. Der Extinktionskoeffizient Spektrum von Wasser (gestrichelte orange Linie) und DM (gestrichelte cyan Linie) wurde skaliert und subtrahiert (rote Linie). Abbildung 6. Reproduziert Massenextinktionskoeffizient-Spektren bei 25 ° C für flüssiges Wasser (http://www.ualberta.ca/ ~ jbertie / JBDownload.HTM # Spectra) und für einen hydratisierten Film der ADP / ATP-Carrier (AAC) 64 . </s> Das Massensterben Koeffizientenspektrum wurde in Lösung für DM (100 mg / ml) in einem hydratisierten Film für bR gemessen und. Figur 7. Transmission des optischen Filters in den zeitaufgelösten Scan-FT-IR-Scan-Messungen. . 8 Leistung der Laserpulse von der zweiten Harmonischen (532 nm) eines Nd:. YAG-Laser Histogramm der Abweichung des relativen Energie von 1000 Laserpulse, und mit einer Gauß-Verteilung mit einer Standardabweichung von 0,05. 1622/51622fig9highres.jpg "width =" 500 "/> Abbildung 9. Lichtinduzierte Absorptionsänderungen von bR an drei repräsentativen Wellenzahlen in gleichmäßigen Zeitabstandsintervalle (grün, schwarz und blaue Linien) und nach quasi-logarithmische Mittelung auf ~ 20 Punkte / Dekade (rote Linien). Beachten Sie die Rauschreduzierung nach logarithmischer Mittelung und enthüllt Schwingung des Zeitspuren im Millisekundenbereich. Abbildung 10. 3D-Darstellung der lichtinduzierten Absorptionsänderungen für bR ATR bei pH 7,4 (4 M NaCl, 100 mM NaPi) aufgezeichnet. A) Raw-Daten. B) rekonstruiert mit fünf Komponenten SVD-Daten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <p class="jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> 11. FT-IR-Differenzabsorptionsspektren des bR Photo an drei ausgewählten Zeitpunkten, wo die L (12,5 &mgr; s), M (300 &mgr; s) und N (6 ms) am Zwischenprodukte angereichert sind. 12. Protonentransfer und Proteinrückgrat Dynamik in den bR-Photo wie durch zeitaufgelöste Step-Scan-FT-IR-Differenzspektroskopie gelöst. Die Absorptionsänderungen bei 1.762 cm -1 Berichte über die Protonierung / Deprotonierung Dynamik Asp85 und bei 1.741 cm -1 auf die Deprotonierung / Reprotonierung Dynamik der Asp96 (einschließlich H-Brücken Änderungen vor 300 Mikrosekunden). Die Zeit-Spuren bei 1.670 und 1.555 cm -1Bericht Änderungen im Amid-I-und-II-Schwingungen, die beide empfindlich auf die Konformation des Peptid-Rückgrat. Die Rück Spuren entsprechen den Rohdaten und die roten auf SVD-Daten behandelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 13. Singulärwertzerlegung (SVD) der Versuchszeitaufgelösten Step-Scan-FT-IR-Daten des bR Photo (siehe Fig. 10A). SVD wurde nach dem Wiegen der experimentellen Daten unter Berücksichtigung der Rauschstandardabweichung abhängig von der Wellenzahl durchgeführt (Fig. 15); in Kombination mit der 1. Ableitung, um die statistische Gewicht der Grundlinie Schwankungen zu reduzieren, wie vor 57. A beschrieben) & #160; Auftragung der relativen singulären Werte der ersten 50 Komponenten (schwarze Kreise). Die ersten fünf Komponenten zugeordnet sind, um Signalkomponenten (rote Kreise). Der Rest der Komponenten exponentiell wie für Lärm-Komponenten zu erwarten (siehe gestrichelte graue Linie). B) Erste acht abstrakten Spektren (U 1 bis U 8). C) Erste acht abstrakten Zeit-Spuren (V 1 bis V 8). Die abstrakte Spektren und Zeitspuren, um die Signal zugeordnet sind, in roten Linien dargestellt und mit schwarzen Linien anders. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 14. 3D-Darstellung von Licht-induzierte IR-Absorptionsänderungen für ChR2 von Step-Scan erfasstim Sendemodus. Die Step-Scan-Daten erstreckt, bis 125 ms, nur für einen Teil der Photo. A) Raw-Daten. B) Daten rekonstruiert mit fünf SVD-Komponenten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 15. Geschätzte Geräuschpegel in einem FT-IR. Unterschied Absorptionsspektrum bei 6,25 Mikrosekunden zeitlicher und 8 cm -1 spektrale Auflösung für ein Experiment mit 1 co-addition/mirror Position (500 Photoreaktionen) oder ~ 200 co-addition/mirror Position (10 5 Photoreaktionen). Die Werte werden für die abgeschwächte Totalreflexion (ATR) und der Getriebeaufbau gezeigt.

Discussion

Einer der ersten Aspekte, die untersucht werden müssen, wenn die Durchführung der zeitaufgelösten Step-Scan-FT-IR-Experimente auf ein Protein ist die Herstellung einer Probe in einer geeigneten Form für die IR-Spektroskopie. Die IR-Absorption aus anderen Quellen als dem Protein von Interesse Substanzen reduziert werden muss, insbesondere die von Wasser. Der häufigste Ansatz ist es, die Wassermasse der Probe zu verdampfen, um einen Film zu bilden. Die Folie kann entweder durch Zugabe einiger Tropfen einer wässrigen Lösung oder durch Aussetzen der Folie einer Atmosphäre mit kontrollierter Feuchtigkeit rehydratisiert werden. Wir haben gezeigt, wie in beiden Fällen ist es möglich, den Wasserhaushalt durch IR-Absorptionsspektroskopie erhalten (siehe Abbildung 3 und Abbildung 5) zu schätzen. Obwohl die erhaltenen Wasserhaushalt vielleicht gering erscheinen im Vergleich zu denen in Lösung, sind sie eigentlich, die denen in lebenden Zellen 70 gefunden, so dass die Studie von hydratisierten Filme von Proteinen funktionell relevant. Neben Wasser, esist auch wichtig zu wissen, und um die Menge der Lipid-oder Reinigungsmittel in der Probe zu steuern. Beide sollten niedrig genug, um eine reduzierte Auswirkung auf die spektroskopische IR-Absorption haben gehalten werden, aber hoch genug, um die Integrität und Funktionalität des Proteins von Interesse zu bewahren.

Zeitaufgelöste Step-Scan-Spektroskopie ist nur unkompliziert für Proteine, die reversiblen Reaktionen, die reproduzierbar durch Licht ausgelöst werden kann (siehe aber Fortschritte bei der Kopplung Step-Scan mit schnellen Pufferaustausch) 71. In Schritt-für-Scan die Reaktion muss für mindestens ~ 500x reproduzierbar sein, um die Mindestanzahl ein Interferogramm für den 1,800-850 cm -1 Region bei 8 cm -1 Auflösung abzuschließen. In der Praxis jedoch, zusätzliche Datenmittelung ist in der Regel erforderlich, um den Geräuschpegel nach unten zu drücken. Für 200 co-additions/mirror Position (10 5 Wiederholungen der Reaktion) kann eine 6,25 Mikrosekunden Auflösung Absorptionsdifferenzspektrum ein Geräusch sta anzeigenndard Abweichung zwischen 2 x 10 -5 bis 2 x 10 -4 für eine ATR und zwischen 5 x 10 -6 bis 3 x 10 -5 für ein Übertragungsexperiment (Abbildung 15). Dank seiner höheren Photonendurchsatz, Getriebe ermöglicht ~ 7 weniger Lärm als ATR, ein wichtiger Aspekt für ein erfolgreiches Studium Proben mit schwacher Absorption Veränderungen wie ChR2. Andererseits erfordert ATR 5 bis 25 Mal weniger Probe als ein Übertragungsexperiment.

Die Anwendung der zeitaufgelösten Step-Scan-FT-IR-Spektroskopie ist problematisch für Proteine, die langsame Photozyklen: Aufzeichnen eines Interferogramms Schritt-Scan kann unpraktisch lang. Einige Lösungen für den Umgang mit solchen Fällen 72,73, die oft auf die Verwendung mehrerer austauschbar Proben auf Kosten der erhöhten Eiweißaufnahme und experimentelle Komplexität 27,74 beschleunigen Messungen vorgestellt. In einigen Fällen ist es möglich, dieses Problem dadurch zu umgehen exunter Berufung auf die Probe, bevor die Photo ist streng abgeschlossen. Für ChR2, mit einem Photo nach Photoanregung 60 Sek. für 99% Rückgewinnung erfordert, ist bereits von 80% 48 die Erholung bei 4 sek. Mit einer Anregungseffizienz von 10% pro Laserpuls, 98% der ChR2 Moleküle sind im dunklen Zustand 4 sec nach Photoanregung, was möglich ist, Experimente bei einer Laserwiederholungsrate auf 0,25 Hz durchzuführen.

Die Datenverarbeitung ist ein Schluss Aspekt erforderlich, um die bestmöglichen Ergebnisse zu erzielen. Die logarithmische Mittelung reduziert Geräusche und, auch wichtig, reduziert die Größe der Daten ohne Verzerrungen, eine Funktion, die für Datenanalyse mit hinteren Einzelwertzerlegung oder globale Montage. Logarithmische Mittelwertbildung ist jedoch nicht sehr erfolgreich bei der Mittelung von Schwankungen in den Zeit Spuren von Schwingungen in dem drehbaren Spiegel und andere 1 / f Rauschquellen bei den Messungen (Abbildung 9) verursacht. Diese Schwankungen in der Grundlinieden Lärm im Millisekundenbereich und korrupt die Qualität der Daten übersteigen. Singulärwertzerlegung nutzt die Redundanz der Daten, um das Rauschen zu reduzieren, und mit einigen Modifikationen 57 kann auch Schwankungen in der Grundlinie zu reduzieren.

Schließlich die härter und zeitaufwendigste Teil eines zeitaufgelösten Step-Scan-FT-IR-Experiment entspricht der Belegung der Bänder und der spektralen und kinetischen Auswertung der Daten. Für Bakteriorhodopsin viele der in den IR-Differenzspektren erscheinen, haben zu der akkumulierten Arbeit von vielen Forschergruppen über Jahrzehnte zugeordnet oder interpretiert Dank. Für eine viel weniger studiert Protein wie Kanalrhodopsin-2, müssen die oben dargestellten zeitaufgelösten IR Experimente durch Parallelversuchen auf ortsgerichtete Mutanten begleitet und mit Informationen aus komplementäre Techniken, um eine mechanistische Interpretation 48 erreicht werden.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by grants from the Deutsche Forschungsgemeinschaft to J.H. (FOR-1279, SFB-1078, B3). We thank Tom Resler and Björk Süss for helpful comments.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
FT-IR spectrometer Bruker Vertex 80v Equipped with photovoltaic-MCT detector, an external global, and an oil-free pump. Firmware 2.3.
BaF2 windows korth Kristalle
diamond ATR accesory Smiths detection Nine-reflection DuraDisk
thermostatic bath Julabo  F25
vibration decoupled table OPTA
Pulsed Nd:YAG laser with a second harmonic generator Continuum electro-Optics Minilite 
Optical parametric oscillator (OPO) OPTA BBO-355-VIS/IR S/N 1009
Digital delay/pulse generator  Stanford Research Systems DG535
Pulsed Nd:YAG laser with a third harmonic generator Spectra-Physics Quanta-Ray
Various optical mirrors and lenses ThorLabs
OPUS 7.0  Bruker Software to control Vertex 80v spectrometer
Matlab run time Mathworks Used to run home-made executable programs to preprocess the data
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Henzler-Wildman, K., Kern, D. Dynamic personalities of proteins. Nature. 450, 964-972 (2007).
  2. Lacapère, J. J., Pebay-Peyroula, E., Neumann, J. M., Etchebest, C. Determining membrane protein structures: still a challenge. Trends Biochem. Sci. 32, 259-270 (2007).
  3. Wöhri, A. B., et al. Light-induced structural changes in a photosynthetic reaction center caught by Laue diffraction. Science. 328, 630-633 (2010).
  4. Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Opt. Express. 20, 2706-2716 (2012).
  5. Neutze, R., Moffat, K. Time-resolved structural studies at synchrotrons and X-ray free electron lasers: opportunities and challenges. Curr. Opin. Struc. Biol. 22, 651-659 (2012).
  6. Austin, R. H., et al. Dynamics of carbon monoxide binding by heme proteins. Science. 181, 541-543 (1973).
  7. Alberding, N., et al. Tunneling in ligand binding to heme proteins. Science. 192, 1002-1004 (1976).
  8. Goormaghtigh, E., Cabiaux, V., Ruysschaert, J. M. Determination of soluble and membrane protein structure by Fourier transform infrared spectroscopy. III. Secondary structures. Subcell. Biochem. 23, 405-450 (1994).
  9. Tamm, L. K., Tatulian, S. A. Infrared spectroscopy of proteins and peptides in lipid bilayers. Q. Rev. Biophys. 30, 365-429 (1997).
  10. Arrondo, J. L., Goñi, F. M. Structure and dynamics of membrane proteins as studied by infrared spectroscopy. Prog. Biophys. Mol. Biol. 72, 367-405 (1999).
  11. Barth, A., Zscherp, C. What vibrations tell us about proteins. Q. Rev. Biophys. 35, 369-430 (2002).
  12. Gerwert, K. Molecular reaction-mechanisms of proteins as monitored by time-resolved FTIR Spectroscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 3, 769-773 (1993).
  13. Maeda, A. Application of FTIR spectroscopy to the structural study on the function of bacteriorhodopsin. Isr. J. Chem. 35, 387-400 (1995).
  14. Kandori, H. Role of internal water molecules in bacteriorhodopsin. Biochim. Biophys. Acta. 1460, 177-191 (2000).
  15. Zscherp, C., Barth, A. Reaction-induced infrared difference spectroscopy for the study of protein reaction mechanisms. Biochimie. 40, 1875-1883 (2001).
  16. Nyquist, R. M., Heitbrink, D., Bolwien, C., Gennis, R. B., Heberle, J. Direct observation of protonation reactions during the catalytic cycle of cytochrome c oxidase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 8715-8720 (2003).
  17. Rich, P. R., Iwaki, M. Methods to probe protein transitions with ATR infrared spectroscopy. Mol. Biosyst. 3, 398-407 (2007).
  18. Noguchi, T. Light-induced FTIR difference spectroscopy as a powerful tool toward understanding the molecular mechanism of photosynthetic oxygen evolution. Photosynth. Res. 91, 59-69 (2007).
  19. Granell, M., Leon, X., Leblanc, G., Padros, E., Lorenz-Fonfria, V. A. Structural insights into the activation mechanism of melibiose permease by sodium binding. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 22078-22083 (2010).
  20. Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 16-26 (2008).
  21. Kapanidis, A. N., Strick, T. Biology, one molecule at a time. Trends Biochem. Sci. 34, 234-243 (2009).
  22. Uhmann, W., Becker, A., Taran, C., Siebert, F. Time-resolved FT-IR absorption spectroscopy using a step-scan interferometer. Appl. Spectrosc. 45, 390-397 (1991).
  23. Dioumaev, A. K., Braiman, M. S. Two bathointermediates of the bacteriorhodopsin photocycle, distringuished by nanosecond time-resolved FTIR spectroscopy at room temperature. J. Phys. Chem. B. 101, 1655-1662 (1997).
  24. Rammelsberg, R., Huhn, G., Lübben, M., Gerwert, K. Bacteriorhodopsin’s intramolecular proton-release pathway consists of a hydrogen-bonded network. Biochimie. 37, 5001-5009 (1998).
  25. Rödig, C., Siebert, F. Errors and artifacts in time-resolved step-scan FT-IR spectroscopy. Appl. Spectrosc. 53, 893-901 (1999).
  26. Brudler, R., Rammelsberg, R., Woo, T. T., Getzoff, E. D., Gerwert, K. Structure of the I1 early intermediate of photoactive yellow protein by FTIR spectroscopy. Nat. Struct. Biol. 8, 265-270 (2001).
  27. Remy, A., Gerwert, K. Coupling of light-induced electron transfer to proton uptake in photosynthesis. Nat. Struct. Biol. 10, 637-644 (2003).
  28. Lórenz-Fonfría, V. A., Furutani, Y., Kandori, H. Active internal waters in the bacteriorhodopsin photocycle. A comparative study of the L and M intermediates at room and cryogenic temperatures by infrared spectroscopy. Biochimie. 47, 4071-4081 (2008).
  29. Griffiths, P. R., de Haseth, J. A. . Fourier Transform Infrared Spectrometry. , (1986).
  30. Smith, G. D., Palmer, R. A. . Handbook of vibrational spectroscopy. , (2002).
  31. Rammelsberg, R., Heßling, B., Chorongiewski, H., Gerwert, K. Molecular reaction mechanisms of protein monitored by nanosecond step-scan FT-IR difference spectroscopy. Appl. Spectrosc. 51, 558-562 (1997).
  32. Rödig, C., Chizhov, I., Weidlich, O., Siebert, F. Time-resolved step-scan Fourier transform infrared spectroscopy reveals differences between early and late M intermediates of bacteriorhodopsin. Biophys. J. 76, 2687-2701 (1999).
  33. Bromberg, S. E., et al. The mechanism of a C-H bond activation reaction in room-temperature alkane solution. Science. 278, 260-263 (1997).
  34. Rödig, C., Siebert, F. . Handbook of vibrational spectroscopy. , (2002).
  35. Braiman, M. S., Xiao, Y. . Vibrational Spectroscopy of Biological and Polymeric Materials. , 353-418 (2006).
  36. Gerwert, K. . Handbook of vibrational spectroscopy. , (2002).
  37. Koutsoupakis, C., Pinakoulaki, E., Stavrakis, S., Daskalakis, V., Varotsis, C. Time-resolved step-scan Fourier transform infrared investigation of heme-copper oxidases: implications for O2 input and H2O/H+ output channels. Biochim. Biophys. Acta. 1655, 347-352 (2004).
  38. Radu, I., Schleeger, M., Bolwien, C., Heberle, J. Time-resolved methods in biophysics. 10. Time-resolved FT-IR difference spectroscopy and the application to membrane proteins. Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1517-1528 (2009).
  39. Haupts, U., Tittor, J., Oesterhelt, D. Closing in on bacteriorhodopsin: progress in understanding the molecule. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 367-399 (1999).
  40. Lanyi, J. K. Bacteriorhodopsin. Annu. Rev. Physiol. 66, 665-688 (2004).
  41. Heberle, J., Fitter, J., Sass, H. J., Büldt, G. Bacteriorhodopsin: the functional details of a molecular machine are being resolved. Biophys. Chem. 85, 229-248 (2000).
  42. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296, 2395-2398 (2002).
  43. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A. 100, 13940-13945 (2003).
  44. Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147, 1446-1457 (2011).
  45. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34, 389-412 (2011).
  46. Feldbauer, K., et al. Channelrhodopsin-2 is a leaky proton pump. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 12317-12322 (2009).
  47. Nack, M., et al. Kinetics of proton release and uptake by channelrhodopsin-2. FEBS Lett. 586, 1344-1348 (2012).
  48. Lórenz-Fonfría, V. A., et al. Transient protonation changes in channelrhodopsin-2 and their relevance to channel gating. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, (2013).
  49. Heberle, J., Zscherp, C. ATR/FT-IR difference spectroscopy of biological matter with microsecond time resolution. Appl. Spectrosc. 50, 588-596 (1996).
  50. Nyquist, R. M., Ataka, K., Heberle, J. The molecular mechanism of membrane proteins probed by evanescent infrared waves. Chembiochem. 5, 431-436 (2004).
  51. Gerwert, K., Freier, E., Wolf, S. The role of protein-bound water molecules in microbial rhodopsins. Biochim. Biophys. Acta. 1837, 606-613 (2014).
  52. Lórenz-Fonfría, V. A., Heberle, J. Channelrhodopsin unchained: Structure and mechanism of a light-gated cation channel. Biochim. Biophys. Acta. 1837, 626-642 (2014).
  53. Carter, R. O., Lindsay, N. E., Beduhn, D. A solution to base-line uncertainty due to MCT detector nonlinearity in FT-IR. Appl. Spectrosc. 44, 1147-1151 (1990).
  54. Noguchi, T., Sugiura, M. Flash-induced FTIR difference spectra of the water oxidizing complex in moderately hydrated photosystem II core films: effect of hydration extent on S-state transitions. Biochimie. 41, 2322-2330 (2002).
  55. Henry, E. R., Hofrichter, J. Singular value decomposition: application to analysis of experimental data. Methods Enzymol. 210, 129-192 (1992).
  56. Hendler, R. W., Shrager, R. I. Deconvolutions based on singular value decomposition and the pseudoinverse: a guide for beginners. J. Biochem. Biophys. Methods. 28, 1-33 (1994).
  57. Lórenz-Fonfría, V. A., Kandori, H. Spectroscopic and kinetic evidence on how bacteriorhodopsin accomplishes vectorial proton transport under functional conditions. J. Am. Chem. Soc. 131, 5891-5901 (2009).
  58. Fischer, H., Polikarpov, I., Craievich, A. F. Average protein density is a molecular-weight-dependent function. Protein Sci. 13, 2825-2828 (2004).
  59. Nagle, J. F., Tristram-Nagle, S. Structure of lipid bilayers. Biochim. Biophys. Acta. 1469, 159-195 (2000).
  60. Lee, A. G. Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochim. Biophys. Acta. 1612, 1-40 (2003).
  61. Goormaghtigh, E., Raussens, V., Ruysschaert, J. M. Attenuated total reflection infrared spectroscopy of proteins and lipids in biological membranes. Biochim. Biophys. Acta. 1422, 105-185 (1999).
  62. Lórenz-Fonfría, V. A., León, X., Padrós, E. Studying substrate binding to reconstituted secondary transporters by attenuated total reflection infrared difference spectroscopy. Methods Mol. Biol. 914, 107-126 (2012).
  63. Bertie, J. E., Lan, Z. D. Infrared intensities of liquids XX: the intensity of the OH stretching band of liquid water revisited, and the best current values of the optical constants of H2O(l) at 25 oC between 15,000 and 1 cm-1. Appl. Spectrosc. 50, 1047-1057 (1996).
  64. Lórenz, V. A., et al. The secondary structure of the inhibited mitochondrial ADP/ATP transporter from yeast analyzed by FTIR spectroscopy. Biochimie. 40, 8821-8833 (2001).
  65. Heßling, B., Souvignier, G., Gerwert, K. A model-independent approach to assigning bacteriorhodopsin’s intramolecular reactions to photocycle intermediates. Biophys. J. 65, 1929-1941 (1993).
  66. Braiman, M. S., et al. Vibrational spectroscopy of bacteriorhodopsin mutants: light-driven proton transport involves protonation changes of aspartic acid residues 85, 96, and 212. 27, 8516-8520 (1988).
  67. Gerwert, K., Souvignier, G., Hess, B. Simultaneous monitoring of light-induced changes in protein side-group protonation, chromophore isomerization, and backbone motion of bacteriorhodopsin by time-resolved Fourier-transform infrared spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 9774-9778 (1990).
  68. Gerwert, K., Hess, B., Soppa, J., Oesterhelt, D. Role of aspartate-96 in proton translocation by bacteriorhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 4943-4947 (1989).
  69. Lórenz-Fonfría, V. A., Kandori, H., Padrós, E. Probing specific molecular processes and intermediates by time-resolved Fourier transform infrared spectroscopy: application to the bacteriorhodopsin photocycle. J. Phys. Chem. B. 115, 7972-7985 (2011).
  70. Ellis, R. J., Minton, A. P. Cell biology: join the crowd. Nature. 425, 27-28 (2003).
  71. Furutani, Y., Kimura, T., Okamoto, K. Development of a rapid Buffer-exchange system for time-resolved ATR-FTIR spectroscopy with the step-scan mode. Biophysics. 9, 123-129 (2013).
  72. Rammelsberg, R., Boulas, S., Chorongiewski, H., Gerwert, K. Set-up for time-resolved step-scan FTIR spectroscopy of noncyclic reactions. Vib. Spectrosc. 19, 143-149 (1999).
  73. Rödig, C., Siebert, F. Monitoring fast reactions of slow cycling systems with time-resolved FTIR spectroscopy. Vib. Spectrosc. 19, 271-276 (1999).
  74. Rödig, C., Siebert, F. Distortion of the L→M transition in the photocycle of the bacteriorhodopsin mutant D96N: a time-resolved step-scan FTIR investigation. FEBS Lett. 445, 14-18 (1999).

Tags

Proton TransferProtein Conformation DynamicsPhotosensitive ProteinsTime-resolved Step-scan Fourier-transform Infrared SpectroscopyInfrared Difference SpectroscopyPhotoreactionProtonation ChangesProtein Backbone ConformationBacteriorhodopsinChannelrhodopsin-2

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Lórenz-Fonfría, V. A., Heberle, J. Proton Transfer and Protein Conformation Dynamics in Photosensitive Proteins by Time-resolved Step-scan Fourier-transform Infrared Spectroscopy. J. Vis. Exp. (88), e51622, doi:10.3791/51622 (2014).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image