マウスにおける神経因性疼痛の坐骨神経細胞浸潤モデル

プロトコルは、「化委員会D'ETHIQUEエンマチエールD'実験ANIMALEデストラスブール」（CREMEAS）によって承認されている。 足撤退のしきい値の1。ベースライン計測マウスは試験手順を開始する前に、2週間に少なくとも10日間、動物施設に慣らすことができます。 フォン·フレイテストのセットアップにし、セクション4で説明されたフォン·フレイ·プロシージャにマウスを慣らす。 手術前に、4.3節で説明したようにvon Freyフィラメントとの機械的な足逃避閾値を評価します。注：少なくとも3つの安定の連続した​​値は、足引っ込め閾値に対して得られるまで、別の日にこの手順を繰り返します。 これらのグループは、最初は足引っ込め閾値について異ならないように、異なる実験群にマウスを割り当てます。 カフImplantatiため2。手術手順上の動物を秤量する。注：マウスの​​体重は、後述するカフ挿入手順のために20グラムの上にあるべきである。 ケタミン（17 mg / ml）を麻酔の約45分を提供する、0.9％のNaCl中のキシラジン（2.5 mg / mlで）の混合物を4ml / kgを腹腔内注射で動物を麻酔。 ピンセットで後肢をつまんで足の反射がないことを確認して、動物が完全に麻酔をかけていることを確認するために、目の反射がないことを確認してください。 電気シェーバーを使用して、腰に膝から右足を剃る。 綿棒で目に目を保護する液体ゲルを適用します。 その左側に動物を置き、小さな枕の上に右後肢を配置し、粘着テープで枕に右後肢を維持している。 クロルヘキシジンおよびガーゼパッドや綿棒を使用して70％エタノールで手術フィールドを消毒。 人差し指を使用して大腿骨を見つけ、作る約0.5cmの切開は、大腿骨の大腿骨と約1.5ミリメートルの前方に平行である。 2オートクレーブ棒で大腿骨に近い筋肉を分離する。注：マッスルをカットしないでください。通常、筋肉層は出血することなく、容易に分離し、坐骨神経は、その後表示されます。出血例では、血液を吸収するために、滅菌綿棒を使用しています。 その主な枝を露出し、坐骨神経の下の2つのオートクレーブ処理スティックを挿入し、滅菌生理溶液（0.9％NaCl）で神経を水和。 スプリット、PE-20ポリエチレンチューブ（カフ）尖った鋼棒の助けとブルドッグクランプで、0.38ミリメートルのID / 1.09ミリメートル外径、事前に準備された無菌の2ミリメートルのセクションを持ちます。 少しして開きますカフの中に先の尖った鋼鉄の棒を挿入します。 カフ側方開口部を用いて、カフの一端にブルドッグを挿入し、カフに平行である。それがでカフを保持するようにブルドッグ（180°）回転させる側面開口部と反対側。ブルドッグを閉じて、尖った鋼鉄の棒を取り外します。注意：回転は保持オンカフを挿入するための最適化された位置にできるようにするために行われ、ブルドッグクランプも、部分的にオープンカフを維持するために支援しています。モデルとブルドッグクランプのサイズは、手順のこのステップのために重要である。 第二実験者が神経の下に2本の棒を持ち、ゆっくりと周囲の4ミリメートルの長さである坐骨神経のセクションへのアクセスを容易にするために、スティックを分離している。 腰に近接する神経の一部の周りのブルドッグの遠位にあるカフの部分を挿入して起動する、坐骨神経の主枝を中心に2ミリメートルカフを挿入します。 チューブの形態を絞るか、変更することなく、ペンチで、その2つの遠位側面に圧力を加えることにより穏やかにカフを閉じます。それが正しく閉じられていることを確認するためにカフをオンにします。 剃毛した皮膚層のウィットを縫合H外科ノット。 きれいなホームケージ内の左側にマウスを置きます。マウスが覚醒するまで加熱ランプ下に保管してください。 余分な水を追加し、ホームケージで直接何らかの餌を置く。 偽対照のため3。手術手順ステップ2.15から2.17に従って、2.9段階にステップ2.1から、上記と同様の手術手順を適用します。偽対照のために、2.14唯一の懸念カフ挿入する手順2.10を省略します。 4。フォン·フライ試験滑らかなステンレス鋼（1 MX 50センチメートル、穿孔の境界線の間に2.5ミリメートルと5ミリメートルの円形の孔）の上昇多孔板に、穴に明確な個々の箱（7センチメートル×9センチ×7センチメートル）にマウスを置きます。注意：最大12匹のマウスが付随してこのセットアップでテストすることができます。手術した動物は、手術の翌日に試験することができる。しかし、回復の3日間において観察された術後の過敏性を減少させることをお勧めします偽対照。 動物は、試験前に15分間馴化することができます。 昇順力のシリーズの各後肢の足底表面にvon Freyフィラメントを適用します。注：von Freyフィラメントを校正直径のプラスチック毛です。それらは、長さ5cmであり、ハンドヘルドアプリケータに固定されている。フィラメントアプリケーション、曲げの程度および適用時間の速度は、この試験3で得られる閾値に影響を与えることができる。マウスにおける本手順では、最も頻繁に使用されるフ​​ィラメントは、0.16、0.4、0.6、1、1.4、2、4、6、8、及び10gである。 フィラメントがちょうど曲がるまで、左の足底面に選ばれたフィラメントを適用します。手順を三から五回連続して繰り返し、[右足に同じことを行う。フィラメントは、両方の足でテストされていたら、次の動物をテストします。注：より敏感である足の横方向の境界線を避けてください。予想される応答は足です撤退、突然後ずさりや足をなめる。少なくとも3予想される応答は5件の試験から認められた場合に陽性と応答を検討してください。所与の足は常に3回試験されるが、1又は2の応答（複数可）は、最初の3つの試験の間に観察され（された）された場合にのみ、第4及び第5の試験が行われる。 C57BL/6Jマウスに、1.4グラムの繊維との手術前のテストを開始します。手術後、0.4グラムの繊維を用いた試験を開始します。肯定的な反応が最初にテストされたフィラメントを用いて観察されている場合は、ステップ4.3.2で（代わりにそれ以上の）下の力のフィラメントをテストします。 4.3.1の手順に従って次の動物に同じフィラメントを適用します。すべての動物がテストされると、大きな力の次のフィラメントとの最初の動物で再度開始してください。すべてのマウスが肯定的な反応を与えるまで、手順を繰り返します。注：2連続したフィラメントが肯定的な反応を与えるまで、各動物をテストします。足のウィットとして肯定的な反応を与えた下糸のグラム値を考慮してこの動物のためのhdrawalしきい値。