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Biologie

A purificação cromatográfica do não-polipéptidos recombinantes Elastina semelhantes e suas fusões com Peptídeos e Proteínas de<em> Escherichia coli</em

Published: June 09, 2014
doi:
10.3791/51583
, ,
1Department of Biomedical Engineering,Duke University, 2Research Triangle MRSEC,Duke University

Summary

Polipeptídeos Elastina-like são biopolímeros de estímulo-responsivo com aplicações que vão desde a purificação da proteína recombinante para a entrega da droga. Este protocolo descreve a purificação e caracterização de polipeptídeos elastina semelhantes e suas fusões de péptido ou proteína a partir de Escherichia coli utilizando o seu comportamento crítico de transição de fase inferior temperatura da solução como uma alternativa simples, a cromatografia.

Abstract

Polipéptidos de elastina-como são biopolímeros repetitivas que exibem um comportamento crítica inferior a temperatura de transição de fase de solução, como unimers solúveis existente abaixo de uma temperatura de transição característica e agregação em coacervatos escala mícron acima da sua temperatura de transição. A criação de polipéptidos de elastina semelhante ao nível genético permite um controlo preciso da sua sequência e comprimento, que determina as suas propriedades térmicas. Polipéptidos de elastina-como são utilizados numa variedade de aplicações, incluindo biosensing, engenharia de tecidos, e a entrega da droga, em que a temperatura de transição e arquitectura biopolímero do PEL pode ser sintonizado para a aplicação específica de interesse. Além disso, o comportamento de transição de fase da temperatura crítica inferior de solução de polipeptídeos elastina semelhantes permite a sua purificação por meio de sua resposta térmica, de tal modo que a sua coacervação selectiva e ressolubilização permite a remoção de ambos os contaminantes solúveis e insolúveiss seguinte expressão em Escherichia coli. Esta abordagem pode ser utilizada para a purificação de si só ou como uma ferramenta para a purificação de péptidos de proteínas ou péptidos recombinantes em que as fusões ou proteínas geneticamente anexas para as etiquetas de polipeptídeos elastina semelhantes podem ser purificados sem cromatografia de elastina-como polipeptídeos. Este protocolo descreve a purificação de polipeptidos semelhantes elastina e suas fusões de péptido ou proteína e discute técnicas básicas de caracterização para avaliar o comportamento térmico de produtos polipeptídicos de elastina puros similares.

Introduction

Polipéptidos elastina semelhantes (ELPS) são biopolímeros compostos da VPGXG pentapéptido de repetição, em que X, o resíduo hóspede, é qualquer aminoácido excepto prolina. ELPs exposição temperatura crítica inferior de solução (LCST) comportamento de transição de fase, de tal forma que uma solução homogênea ELP vai separar em duas fases após aquecimento à sua LCST, o que é comumente chamado de temperatura de transição inversa (T t) na literatura ELP 1. As duas fases são constituídas por uma fase muito diluída glóbulo ELP e uma fase rica sedimento ELP. Os ricos sedimentos ELP é formado em um curto espaço de tempo após a agregação das cadeias ELP em partículas micro-empresas que, posteriormente, se aglutinam. Este comportamento ocorre ao longo de um intervalo de alguns graus Celsius e está geralmente reversíveis, como uma solução homogénea é recuperada após retorno a uma temperatura inferior a T t.

ELPs são tipicamente sintetizados em Escherichia coli (E. coli) from um gene artificial que é ligado a um plasmídeo de expressão. Este plasmídeo é então transformado num E. linha celular de E. coli, que é óptimo para a expressão da proteína. Temos usado exclusivamente o sistema de vetor T7-lac pET para a expressão de uma grande variedade de ELPs em E. coli, embora outros sistemas de expressão em levedura 2-4, 5 fungos, plantas e 6-8, também têm sido utilizados por outros investigadores. Uma série de abordagens existem para construir genes geneticamente ELP repetitivas, incluindo ligadura recursiva direcional (RDL) 9, ligadura direcional recursiva por plasmídeo reconstrução (pré-RDL) 10, e se sobrepõem extensão rolamento círculo de amplificação (OERCA) 11. A capacidade para manipular ELPs a nível genético permite a oportunidade de usar técnicas de DNA recombinante para criar ELPs com uma variedade de arquitecturas de (por exemplo, monoblocos, diblocos, triblocos, etc), que pode ainda ser acrescentada com funcionalpeptídeos e proteínas. Controle no nível genético também garante que cada ELP é expressa com o comprimento ea composição ditada por seu modelo plasmídeo genética exata, fornecendo produtos de biopolímeros perfeitamente monodispersos.

As propriedades térmicas de cada ELP depender de parâmetros intrínsecos ao biopolímero tal como o seu peso molecular (PM) e da sequência, assim como factores extrínsecos, incluindo a sua concentração em solução e na presença de outros cosolutes, tais como sais. O comprimento do ELP 12 e sua composição resíduo convidado 1, 13, 14 são dois parâmetros ortogonais em design ELP que podem ser usados ​​para controlar o T t, em que os resíduos de hóspedes hidrofóbicas e comprimentos de cadeia mais longa resultará em menor T t s, enquanto hidrofílico resíduos de hóspedes e comprimentos de cadeia mais curta resultar em maior T t s. Concentração ELP está inversamente relacionado com a T t, onde as soluções de grconcentração comedor ELP têm menor T t s 12. O tipo e concentração de sais também influenciar o ELP T t, onde o efeito de sais segue a série de Hofmeister 15. Ânions cosmotrópicos (Cl – e maior na série de Hofmeister) reduzir o ELP T t e aumento da concentração de sal aumenta esse efeito. Estes parâmetros intrínsecos e extrínsecos podem ser ajustados para se obter um comportamento térmico dentro de um intervalo de temperatura alvo, que é necessário para uma aplicação específica de uma ELP.

O comportamento estímulo-responsivo de ELPs é útil para uma gama diversificada de aplicações, incluindo biosensing 16, 17, 18 a engenharia de tecidos, e entrega da droga 19, 20. Além disso, quando ELPs são fundidas com os péptidos ou proteínas a nível genético, o ELP pode servir como uma marca de purificação simples para proporcionar um método barato para a purificação de lote de pep recombinantemarés ou proteínas que não requer cromatografia 21. Modificação do processo de purificação assegura que a actividade do péptido ou proteína de fusão para o ELP é mantida. Péptido ou proteína ELP fusões podem ser purificados para aplicações em que a etiqueta ELP é útil 22, 23, ou alternativamente, quando é necessário o péptido livre ou de proteína, um local de reconhecimento de protease pode ser inserido entre o péptido ou proteína e ELP. A remoção do tag ELP pode ser alcançado através da digestão com protease livre ou uma fusão ELP protease, onde a última oferece a facilidade adicional de processamento como uma rodada final de ELP purificação pode separar o ELP tag e protease ELP fusão do peptídeo alvo ou proteína num único passo 24, 25. O protocolo seguinte descreve o procedimento de purificação para ELPs e péptidos ou ELP fusões de proteína por meio das suas propriedades térmicas e discute técnicas básicas para caracterizaro comportamento térmico de produtos ELP.

Protocol

1. ELP Expression Inocular 3 ml de meio Terrific Broth estéreis com um estoque DMSO ou placa de ágar colônia de E. coli adequada para a expressão da proteína que contém o plasmídeo ELP-codificação desejada sob o controlo do promotor de T7-lac. Adicionar o antibiótico apropriado e incubar a 37 ° C durante a noite (O / N) com agitação contínua a 200 rpm. Adicionar 1 ml de cultura O / N a 1 L de Terrific Broth meio estéril em um balão de 4 L. Adicionar o antibiótico apropriado e incubar a 37 ° C durante 24 h, com agitação contínua a 200 rpm. NOTA: O "permeável" a expressão da linha de base observado com o promotor de T7-lac é suficiente para a expressão de nível elevado de muitos ELPs se a cultura é incubada durante 24 horas. No entanto, uma abordagem mais convencional pode ser utilizado, em que a expressão de proteínas é ainda induzida pela adição de 0,2-1 mM de isopropil-beta-D-tiogalactósido (IPTG), quando a densidade óptica da cultura chega a 0,6. </li> Transferir a cultura do balão de 4 L com uma garrafa de centrífuga de 1 L e centrifuga-se a 4 ° C durante 15 min a 2.000 x g. Desprezar o sobrenadante. NOTA: Se mais de 1 L de cultura é cultivada eles podem ser condensados ​​por adição de mais um litro de cultura para o sedimento e repetindo o passo 1.3. Até 2 L de cultura pode ser condensado em um único pelete celular. Ressuspender o sedimento em tampão fosfato salino (PBS), água, ou outro tampão desejado para atingir 45 ml de suspensão de células e transferir para um tubo de 50 ml. 2 ELP purificação:. Etapas preliminares e Primeira Rodada de Inverse Transição Ciclismo Sonicar a pelete celular foi novamente suspensa para um total de 9 minutos em ciclos de 10 seg 'on' e 20 segundos "off" com uma potência de saída de 85 W, mantendo a amostra em gelo. Resumidamente permitir que a amostra esfriar no gelo e, em seguida, repita a 9 min ciclo mais uma vez. NOTA: Se o ELP está prevista para ter uma muito baixa T t </sub> o intervalo de 'off' pode ser aumentado até 40 segundos para evitar o aquecimento da solução acima do T t. Transferir o lisado para uma de 50 ml de fundo redondo tubo de centrífuga. Adicionar 2 ml de 10% (w / v) polietileneimina (PEI) para cada litro de cultura e agite para misturar. NOTA: PEI é um polímero carregado positivamente, que auxilia na condensação dos contaminantes genéticos carregados negativamente. Não execute esta etapa se o ELP é carregada negativamente, como o PEI também pode condensar e remover o produto ELP. Centrifugar a 4 ° C durante 10 min a 16.000 x g. Transferir o sobrenadante para um ambiente limpo 50 ml rodada tubo de centrifugação de fundo e descartar o sedimento. Opcional "cozer a" etapa: incubar a amostra a 60 ° C durante 10 minutos para desnaturar os contaminantes de proteína e, em seguida, transferir a 4 ° C ou de gelo até o ELP é completamente ressolubilizado. Centrifugar a amostra a 4 ° C durante 10 min a 16.000 x g. Transfira o sobrenadante para um clean 50 ml rodada tubo de centrifugação de fundo e descartar o sedimento. NOTA: Não realizar este passo, se um péptido ou proteína é fundida com o PEL e espera-se desnaturar na condição de calor elevado. Isto pode causar a transição ELP a tornar irreversível ao calor ou podem destruir a actividade da porção fundida. Induzir a transição ELP com a adição de NaCl cristalino (não superior a 3 M). Alternativamente, o citrato de sódio (não superior a 0,3 M) pode ser usado para ELPs que têm maior T t s ou baixos rendimentos. NOTA: A solução deve ficar turva uma vez que o sal se dissolveu, o que indica a fase de separação da solução de PEL. ELPs muito hidrofílicos com alta T t s pode exigir um certo grau de aquecimento, em combinação com a adição de sal, para induzir a separação de fases do PEL neste indução preliminar da transição ELP. Centrifugar a temperatue ambiente (RT) por 10 min a 16.000 xg (spin quente). NOTA: Um pellet ELP deve bE observado, cujo tamanho depende do rendimento do PEL expressão. Este pellet ELP pode parecer à primeira vista opaca, mas após o resfriamento ele aparecerá translúcida e pode ser na cor marrom. O pellet ELP se tornará mais incolor como purificação de receitas e contaminantes são removidos. Descartar o sobrenadante e adicionar 1-5 mL de tampão desejado para o pelete. Ressuspender o sedimento por pipetagem ou definindo o tubo para rodar a 4 ° C. NOTA: O volume requerido de tampão vai depender do tamanho do sedimento ELP, e, assim, o rendimento da expressão ELP, onde uma quantidade suficiente de tampão deve ser adicionado para permitir a ressolubilização do pelete ELP. ELPs com benefício alto teor de cisteína a partir de purificação em água com tampão Tris 10 mM de cloridrato de (2-carboxietil) fosfina (TCEP-HCl) a um pH de 7 a eliminar interacções dissulfureto, com as proteínas contaminantes. ELPs com benefício elevado teor de carga de purificação a um pH ajustado para neutralizar a sua carga e reduzir elementoctrostatic interacções com as proteínas contaminantes. Transferir a solução ELP ressuspenso em 1 ml de partes alíquotas em tubos de microcentrífuga limpo de 1,5 ml. Centrifugar a 4 ° C durante 10 minutos a 16.000 xg (spin frio). Uma pequena bolinha de contaminantes insolúveis devem ser observadas. Transferir o sobrenadante para um tubo limpo e descartar o sedimento. . 3 ELP Purificação: rodadas subseqüentes de Inverse Transição Ciclismo Induzir a transição ELP com calor e / ou a adição de NaCl. As amostras podem ser incubadas num bloco de aquecimento ou em banho-maria durante 15 minutos a uma temperatura superior a T t. Se, no entanto, o ELP é fundida a uma proteína (excluindo a utilização de calor) ou se o PEL tem um elevado t T, que não pode ser alcançado com o calor sozinho, uma solução de NaCl a 5 M pode ser adicionada gota a gota para induzir a transição ELP. NOTA: A solução deve turvar, indicando a separação de fases do ELP da solução. <li> Centrífuga por 10 min a 16.000 xg (spin quente). Se o calor foi usado no passo 3.1, executar este passo de centrifugação a uma temperatura acima do que foi necessário para induzir a transição ELP. Se só NaCl foi utilizado na etapa 3.1, realizar esta etapa de centrifugação à TA. Nota: Um pellet ELP devem ser observadas. Rejeitar o sobrenadante, adicionar 500-750 ul de tampão desejado, e ressuspender o sedimento por pipetagem ou definindo o tubo para rodar a 4 ° C. Centrifugar a 4 ° C durante 10 minutos a 16.000 xg (spin frio). Uma pequena bolinha de contaminantes insolúveis devem ser observadas. Transferir o sobrenadante para um tubo limpo e descartar o sedimento. Repita os passos 3.1 a 3.5 até que nenhum sedimento contaminante é observado durante a etapa 3.4. 4. Processamento Pós-purificação (opcional) Se desejado, a amostra dializar contra um tampão adequado para remover o excesso de sal a partir da solução purificada ELP. NOTA: ELPs ser liofilizados devem serdialisados ​​contra DDH 2 OO / N a 4 ° C. Se desejado, liofilizar o ELP para armazenamento a longo prazo por congelação da solução a -80 ° C durante 30 min antes da liofilização S / N. NOTA: a liofilização não deve ser utilizado para ELPs com proteínas anexas. Se desejado, recuperar o péptido livre ou proteína a partir de um péptido ou proteína de fusão ELP removendo a etiqueta ELP: Digerir o péptido ou proteína de fusão com protease ELP biotinilada (como recomendado pelo fornecedor de protease) ou com uma fusão de protease ELP correspondente ao sítio de protease geneticamente concebido entre o péptido ou proteína e ELP. Se for o caso, remover a protease biotinilado utilizando pérolas modificadas com estreptavidina (como recomendado pelo fornecedor de protease). Induzir a transição do ELP clivada e / ou ELP fusão protease pela adição gota a gota de uma solução 5 M de NaCl. Centrifuga-se a TA durante 10 min a 16.000 x g. Nota: Um pellet ELP devem ser observadas. Recolher o sobrenadante e descartar o pellet ELP. Dialisar o sobrenadante contra um tampão desejado ou usar um filtro centrífugo para realizar uma troca do tampão, a fim de remover a elevada concentração de sal a partir do péptido puro ou uma solução de proteína. Confirmar a clivagem completa do péptido livre ou proteína a partir da etiqueta ELP por dodecil sulfato de sódio a electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). 5 Caracterização:. SDS-PAGE Preparar amostras ELP para SDS-PAGE através da mistura de 10 uL de ELP diluído em água com 10 ul de tampão de amostra contendo 2-mercaptoetanol. NOTA: 40 ug de ELP é muitas vezes suficiente para avaliar o tamanho e pureza do produto ELP. Incubar a amostra a 100 ° C durante 2 min e, em seguida, carrega-se num gel de poliacrilamida juntamente com uma escada de proteína de tamanho apropriado. Submeter o gel a 180 V até que o corante aproxima-se do fundo do gel (cerca de 45 min). Manchar ogel com uma solução 0,5 M de CuCl 2 por 5 min, enquanto que de balanço. NOTA: ELPs normalmente não são visualizadas por Coomassie Brilliant mancha azul, como algumas seqüências ELP não interagem com este corante. Azul Brilhante de Coomassie interage principalmente com resíduos de arginina e interage fracamente com outros resíduos de histidina de base e de lisina e resíduos aromáticos-triptofano, tirosina e fenilalanina 26. Assim ELPs e péptido ou proteína ELP fusões podem ser corados com Azul Brilhante de Coomassie apenas se a sua sequência primária inclui um número suficiente destes resíduos específicos. Verificar que o PM do ELP banda corresponde à do MW teórico esperado a partir do gene CEL e que não há bandas de contaminantes externos estão presentes. NOTA: Alguns ELPs migrar com uma aparente MW até 20% maior do que o seu MW esperado 9, 27. 6 Caracterização:. Matriz assistida por laser de Dessorção /ionização Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF-MS) Prepara-se uma solução de PEL em 50% de acetonitrilo aquoso contendo ácido trifluoroacético a 0,1% para se obter uma concentração de cerca de PEL 25 uM. NOTA: Esta solução deve ser livre de sal, para ELP deve ser dialisados ​​contra H2O após purificação. Prepara-se uma solução matriz de ácido sinapinico saturada em 50% de acetonitrilo aquoso contendo ácido trifluoroacético a 0,1%. Adicionar 1 ml de solução ELP a 9 ul da solução de matriz para alcançar uma concentração de cerca de 2,5 ELP pmoles / ul. NOTA: esta mistura pode ser ainda mais diluída com solução de matriz para optimizar o sinal de MALDI-TOF. Depósito 1-2 ul da mistura ELP-matriz sobre uma placa de metal de MALDI e deixar o local secar completamente. Obter 5-10 espectros com MALDI-TOF para determinar a massa de cobrar taxa de (m / z) do ELP e inferir a sua MW medido. 7. Characterization: Turbidimetria e espalhamento dinâmico de luz à temperatura programada Determine o T t do ELP por turbidimetria a temperatura programada: Prepara-se uma série de diluições (por exemplo, de 5-100 fiM) de soluções ELP no tampão desejado. Usando um espectrofotómetro de UV-Vis com temperatura controlada, medir a densidade óptica (DO) a 350 nm ao longo de um intervalo de temperaturas (por exemplo, 20-80 ° C) a uma taxa de aquecimento de 1 ° C / min. NOTA: Se não houver aumento de OD é visto o T t pode exceder o limite superior da temperatura do instrumento. A t t aparente pode ser diminuída pela adição de NaCl. Iniciar a 1 M de NaCl e aumentar em passos de 0,5 M até a transição ELP é detectada dentro de um intervalo de temperatura mensurável. Verificar a reversibilidade da transição ELP medindo a diminuição no OD durante o mesmo intervalo de temperatura, a uma taxa de arrefecimento de 1 ° C / min. Determine o T t do homopolímero ELP, identificando o ponto de inflexão no perfil de turbidez (DO traçada em função da temperatura). NOTA: Esta temperatura pode ser facilmente definida a partir do derivado da curva de OD, em que a temperatura correspondente ao máximo do derivado é definido como o T t. Arquiteturas ELP mais complexos irá exibir perfis de turbidez mais complicadas e deve continuar a ser analisados ​​como descrito na seção 7.2. A caracterização adicional do ELPs que exibem propriedades térmicas mais complexos (por exemplo, copolímeros de dibloco ELP que se auto-montar em micelas esféricas) é obtido por dispersão de luz dinâmica (DLS): Prepara-se uma solução ELP no tampão desejado e fazer passar a amostra através de um filtro com um tamanho de 20-450 nm de poro. NOTA: A escolha do tamanho dos poros do filtro dependerá da presença, tamanho, e a estabilidade de quaisquer conjuntos de PEL em solução. O menor tamanho dos poros do filtro viável é o preferido para eliminar os contaminantes, como por exemplopoeira, que diminuem a qualidade de medidas de DLS. A tamanho dos poros do filtro maior deve ser usado quando a resistência significativa é experimentado quando se passa uma solução ELP através de poros do filtro menores. Medir o raio hidrodinâmico (R H) ao longo de um intervalo de temperaturas que corresponde a uma região de interesse identificada no perfil de turbidez. NOTA: unimers ELP normalmente têm um R H <10 nm, as assembléias de nanopartículas têm um R H ~ 20-100 nm e agregados têm um R H> 500 nm. Cada aumento em I H deve corresponder a um aumento da densidade óptica a 350 nm, medido por espectrofotometria de UV-Vis, como uma função da temperatura, que é proporcional ao tamanho da partícula.

Representative Results

Aqui descrevemos resultados representativos para a purificação e caracterização de um homopolímero e um copolímero de ELP dibloco ELP. Após 24 horas de expressão em E. coli, as células são recolhidas por centrifugação e lisadas por sonicação. Tipicamente, uma mudança na cor subtil ocorre após sonicação, confirmando a lise celular suficiente (Figura 1A). Após a adição de PEI, componentes genómicos e os restos celulares são recolhidas por centrifugação, a separação de uma grande pelota de contaminantes insolúveis do ELP solúvel no sobrenadante (Figura 1B). ELP é ainda purificado por inversa ciclismo transição (ITC), que explora o comportamento TCIS para separar o PEL de contaminantes ambos solúveis e insolúveis (Figura 2) 28. A transição de fase do ELP é desencadeada pela adição de calor e / ou sal. Resultados da centrifugação a formação de um sedimento no fundo do tubo que é constituído por um ELPnd alguns contaminantes insolúveis (Figura 1C). Este passo denominado um spin-descarta quentes contaminantes solúveis no sobrenadante enquanto o sedimento ELP é retido e ressuspenso em tampão frio. O ressolubilizado ELP é centrifugado de novo a 4 ° C. Este passo-denominado um resfriado spin-devoluções a pelota de contaminantes insolúveis enquanto o sobrenadante contendo ELP solúvel é mantido. Repetir o ciclo de rotações alternadas quentes e frios aumenta a pureza do PEL, mas ao custo de diminuir ligeiramente o rendimento, como ELP residual é perdida durante cada ronda ITC em tubos de centrífuga e em pontas de pipeta. Purificação bem sucedida de ELPs e péptido ou proteína fusões ELP é confirmada por SDS-PAGE. Pequenos aliquotas tomadas ao longo do processo de purificação demonstram a purificação progressiva de ELP do E. lisado de E. coli. ELP é sobre-expresso na E. bruto lisado e contaminantes coli diminuir sagacidadeh sucessivas rondas de ITC (Figura 3). Purificada ELP aparece como uma única banda perto do MW teórico previsto. O ELP T t é caracterizada por turbidimetria a temperatura programada. O perfil de turvação de um homopolímero ELP exibe um único aumento acentuado na OD a 350 nm (cerca de 2,0 unidades acima do valor inicial de uma concentração de 25 uM ELP) (Figura 4A). Arrefecimento varreduras turbidez confirmar a natureza reversível da transição ELP como o OD retorna à linha de base, quando a temperatura é reduzida abaixo da T t (Figura 4B). ELP copolímeros dibloco exibem um perfil de turvação mais complexo, em relação ao homopolímero ELPs. O OD primeiro tipicamente aumenta a 0,1-0,5 unidades acima do valor inicial, após o que os OD aumenta abruptamente para 2,0 unidades acima do valor basal (Figura 5A). DLS medições fornecem informações sobre a mudança de R H, com respeito à temperatura, co rroborating as informações obtidas a partir do perfil de turbidez (Figura 5B). Figura 1. Preliminar purificação ELP. Após 24 horas de expressão, E. coli As células são recolhidas por centrifugação e ressuspensas em PBS. A) As células são lisadas por ultra-sons, que é acompanhado por uma alteração subtil de cor de tal modo que o lisado escurece após sonicação. B) Após a adição de PEI a condensar os contaminantes de ADN, o lisado é centrifugada e um grande pellet de detritos insolúveis são separados do ELP solúvel no sobrenadante. C) A transição ELP é induzida com a adição de calor e / ou sal e as formas de centrifugação a pelota ELP translúcida.ank "> Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Ciclismo transição Figura 2. Inversa. ELP é purificado por meio de seu comportamento TCIS de contaminantes ambos solúveis e insolúveis. Começando com o lisado ELP-rico (1) a transição ELP é induzida com a adição de calor e / ou sal e do ELP é separado por centrifugação (spin quente) (2). O sedimento ELP é retido (3a), enquanto que o sobrenadante contendo os contaminantes solúveis é descartada (3b). O ELP é ressuspenso em tampão frio (4) e novamente centrifugado a 4 ° C (de centrifugação a frio) (5). O sedimento que contém os contaminantes insolúveis é descartada (6a), enquanto o sobrenadante contendo ELP solúvel é mantido (6b). Ciclos alternados de rotações quentes e frias são repetidos até que a pureza desejada é alcançada, tal como determinado comSDS-PAGE. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. A análise de SDS-PAGE a Figura 3. De produtos de purificação de ELP. Purificação bem sucedida de uma ELP é confirmada por SDS-PAGE. Superexpressos ELP é evidente na E. bruto lisado de E. coli após ultra-sons (2). Após a adição de PEI e centrifugação a ELP solúvel é, em grande parte mantida no sobrenadante (3), apesar de alguns ELP é perdida no sedimento descartado de contaminantes insolúveis (4). O sobrenadante após a primeira rodada quente contém níveis significativos de contaminantes solúveis (5). O sobrenadante após a primeira rodada fria indica uma boa separação dos ELP de contaminantes insolúveis (6). Ciclos adicionais de quente (7) e cidade gira (8) remover os contaminantes solúveis e insolúveis residuais, respectivamente, até (9) e de rotação (10) a frio quente sobrenadantes finais não apresentam bandas de contaminantes estranhos, confirmando a pureza satisfatória do produto ELP. Este homopolymer ELP, com uma seqüência de SKGPG-(VGVPG) 80-Y, tem um peso molecular esperado de 33,37 kDa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4. Caracterização de ELP homopolímero por turbidimetria a temperatura programada. ELP A T T é determinada pela monitorização da densidade óptica a 350 nm, enquanto que o aumento da temperatura a uma taxa de 1 ° C / min. UM) homopolímeros ELP exibem um único aumento acentuado na OD que defines seu T t a uma dada concentração. B) A reversibilidade da transição ELP é verificada por meio de monitorização da densidade óptica a 350 nm de uma solução a 25 μ M, enquanto a diminuição da temperatura, em que a reversibilidade é confirmada pelo retorno do OD de linha de base. Este homopolymer ELP tem a seqüência SKGPG-(VGVPG) 80-Y. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5. Caracterização do ELP copolímero diblock por turbidimetria a temperatura programada e espalhamento dinâmico de luz. ELPs que se submetem a nano-escala de auto-montagem, como ELP copolímeros diblocos que se juntam em micelas esféricas, apresentam perfis de turbidez mais complexos. <strong> A) Moderado aumento OD indica a transição de unimers de micelas, antes de um rápido aumento na OD que indica agregação completa do PEL em agregados escala mícron medições. DLS B) confirmam o comportamento inferida a partir do perfil para uma turbidez solução a 25 mM, fornecendo informações sobre a mudança de R H em relação à temperatura. Aqui o Unimer ELP tem um R H ~ 8 nm e da micela tem um R H ~ 25 nm. Este copolímero diblock ELP tem a seqüência GCGWPG-(VGVPG) 60 – (AGVPGGGVPG) 30 PGGS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

ELPs oferecer um meio barato e livre de cromatografia de purificação por exploração do seu comportamento de fase de estímulo-resposta. Esta abordagem toma vantagem do comportamento TCIS de ELPs e péptidos ou ELP proteína fusões de eliminar ambos os contaminantes solúveis e insolúveis após expressão de ELPs geneticamente codificados em E. coli. Esta facilidade de purificação pode ser utilizado para produzir ELPs para uma variedade de aplicações, ou podem ser exploradas para a purificação de péptidos recombinantes ou proteínas, em que o ELP pode actuar como uma marca de purificação que pode ser removido com o processamento pós-purificação.

ELP purificação envolve etapas preliminares para lisar a E. coli e remover os detritos celulares insolúveis genómico e a partir do lisado da cultura em bruto (Figura 1), seguido por remoção de contaminantes solúveis e insolúveis residuais por ITC (Figura 2). Centrifugação após a activação da transição ELP pela adição de calor ou sal se separa do PEL de contaminantes solúveis no sobrenadante, numa etapa denominada de rotação quente. Após resolubilizing ELP, a solução é centrifugada de novo a uma temperatura inferior a T t para remover o pelete de contaminantes insolúveis, num passo denominado um spin frio. Alternando rotações quentes e frios aumenta a pureza da solução ELP com cada ciclo, com um custo pequeno para produzir. Os rendimentos de purificação variar dependendo do ELP T t, comprimento, e peptídeos ou proteínas fundidas. Normalmente, este protocolo produz 100 mg de ELP purificado por litro de E. cultura coli, porém os rendimentos podem chegar a até 500 mg / L. A pureza do produto final ELP é confirmada por SDS-PAGE (Figura 3). O MW do ELP purificada deve corresponder de perto com o MW teórico codificada pelo gene ELP. No entanto, alguns ELPs migrar em SDS-PAGE com um aparente MW até 20% mais elevado do que o PM esperado 9, 27. Uma análise mais precisa do ELPMW pode ser alcançado por MALDI-TOF-MS, o que também pode fornecer informação adicional sobre a pureza do produto ELP, juntamente com as técnicas analíticas ortogonais, tais como a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).

Após purificação, o ELP T t é medido por turbidimetria a temperatura programada. Esta técnica monitora o OD de uma solução ELP, enquanto a temperatura é aumentada. O T t é dependente da concentração, por isso é aconselhável para caracterizar uma série de concentrações relevantes para a aplicação pretendida do ELP. Para ELP homopolímeros o perfil turbidez exibe um único aumento acentuado que corresponde à transição de ELP UNIMER agregados à escala mícron (Figura 4A). A t t é definido como a temperatura correspondente ao ponto de inflexão no perfil de turbidez, precisamente determinado como o valor máximo da primeira derivada do OD em relação à temperatura. A reversibilidade doTransição de fase ELP é confirmada por uma diminuição na OD a linha de base como a temperatura é reduzida abaixo da T t (Figura 4B). O perfil de turbidez com o aumento da temperatura ea diminuição rampas serão diferentes em magnitude e cinética devido à resolução de coacervates ELP e histerese variável do ELP ressolubilização. Péptido ou proteína ELP fusões de apresentar um comportamento semelhante TCIS, desta forma, em que o péptido ou proteína de fusão para o ELP afecta o T t. Para a proteína ELP fusões a transição é reversível abaixo da temperatura de fusão da proteína. Enquanto turbidimetria a temperatura programada é um excelente método para a caracterização térmica inicial de produtos ELP, técnicas alternativas, tais como calorimetria de varrimento diferencial (DSC), também pode ser utilizado para medir o ELP T t.

ELPs com comportamentos térmicos arquitecturas exposição mais complicados mais complexos, que também pode ser caracterizada pela temperatura progra-turbidimetria mmed. ELP copolímeros de dibloco, por exemplo, apresentam um perfil de turvação característica correspondente à sua auto-montagem desencadeada-temperatura em micelas esféricas na sua temperatura crítica de micelização. Para estes copolímeros dibloco ELP a OD tipicamente primeiro aumenta 0,1-0,5 unidades acima do valor basal, indicando a transição de unimers para micelas, após o que um aumento acentuado na OD (até 2,0 unidades acima do valor inicial), a uma temperatura mais elevada indica a formação de micro-escala agregados (Figura 5A). Informações adicionais sobre a auto-montagem de estruturas ELP desencadeada de temperatura é obtida com DLS, uma técnica que mede a R H de conjuntos ELP em solução. Alterações em R H concorda estreitamente com as mudanças na OD medidos com turbidimetria (Figura 5B). Unimers ELP normalmente exibem um R H <10 nm, enquanto os conjuntos de nanopartículas apresentam um R H ~ 20-100 nm e agregados exibem um R H </sub >> 500 nm. Informação adicional sobre as nanopartículas ELP auto-montadas, como o número de agregação e morfologia, pode ser obtida por dispersão de luz estática ou microscopia electrónica de transmissão criogénica 17, 23, 29.

Devido à tunability das propriedades térmicas ELP, uma gama de T t s é obtida por vários projetos ELP. É importante ter em mente que o inerente T t irá influenciar a otimização do protocolo de purificação para cada ELP, onde extremamente baixa ou alta T t s vai exigir o máximo modificação a este protocolo padrão. ELPs com temperaturas extremamente elevadas de transição pode não ser adequada para a purificação com esta abordagem. Se a concepção de novos ELPs e péptidos ou ELP proteína fusões podem comprometer o comportamento térmico do PEL, um marcador de histidina simples pode ser incluído para a purificação por meio de cromatografia de afinidade alternativo de metal imobilizado. Adicionalmente,características da seqüência ELP pode exigir a modificação deste protocolo se o resíduo de hóspedes está carregada. A manipulação do pH pode ser usado como um método para alterar a carga global do PEL num esforço para eliminar as interacções electrostáticas com os contaminantes 17. Além disso, este protocolo é apropriado para a circunstância especial de fusões ELP com peptídeos e proteínas quando são tomadas medidas adequadas para garantir que o processo de purificação não perturbar a atividade da porção fundida. Notas em todo o protocolo sobre as modificações servem para direcionar a purificação da ELPs que podem apresentar estes desafios com relação a T t, carga, ou preocupações de fusão.

A purificação de ELPs por meio de seu comportamento TCIS apresenta uma abordagem simples e livre de cromatografia para purificar a maioria dos péptidos e ELPs ELP ou fusões de proteínas expressas em E. coli. O protocolo resumido aqui permite purificação of ELPs em um único dia, utilizando equipamentos que são comuns à maioria dos laboratórios de biologia. A facilidade de purificação de ELPs e suas fusões será, esperamos, incentivar uma crescente diversidade de projetos ELP para novas aplicações em ciência dos materiais, biotecnologia e medicina.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela Research Triangle MRSEC da NSF (DMR-1121107).

Materials

pET-24a(+)
pET-25b(+)		 Novagen 69749-3
69753-3		 T7-lac expression vectors with resistance to kanamycin (pET-24) or ampicillin (pET-25).
Ultra BL21 (DE3) competent cells Edge BioSystems 45363 Competent E. coli for recombinant protein expression.
Terrific Broth (TB) Dry Powder Growth Media MO BIO Laboratories 12105 Media is reconstituted in DI H2O and autoclaved before use.
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) Gold Biotechnology I2481C IPTG is reconstituted in DI H2O, sterile filtered, and added to cultures to induce enhanced expression.
Phosphate buffered saline (PBS) tablet Calbiochem 524650 These PBS tablets, when dissolved in 1 L of DI H2O, yield a 10 mM phosphate buffer with 140 mM NaCl, and 3 mM KCl with a pH of 7.4 at 25 °C.
Polyethyleneimine (PEI) Solution (~50% w/v) MP Biomedicals 195444 PEI is prepared as a 10% (w/v) solution in deionized H2O.
Nalgene Oak Ridge high-speed centrifuge tubes, 50 mL Thermo Scientific 3138-0050 These round-bottom tubes withstand high-speed centrifugation of 30-50 ml.
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP-HCl) Thermo Scientific 20491 A stock solution of TCEP-HCl is prepared at 100 mM in DI H2O and adjusted to pH 7.0. For ELPs with a high cysteine content the stock solution of this reducing agent is added to the ELP pellet to reach 10 mM in H2O.
Ready Gel Tris-HCL gel, 4-20% linear gradient polyacrylamide gel, 10 well, 30 μl Bio-Rad Laboratories 161-1105 These linear gradient gels offer good visualization of ELPs with a range of MWs.
Cupric chloride dihydrate (CuCl2-2H2O) Fisher Scientific C454-500 A filtered 0.5 M solution is prepared for negative staining of Tris-HCL polyacrylamide gels.
Anotop 10 syringe filter:
0.02 μm
0.1 μm
0.2 μm		 Whatman 6809-1002
6809-1012
6809-1022		 These 10 mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes for DLS measurements.
Millex-HV filter:
0.45 μm		 EMD Millipore SLHVX13NK These 13 mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes of solutions with large nanoparticle assemblies for DLS measurements.
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References

  1. Urry, D. W. Physical Chemistry of Biological Free Energy Transduction As Demonstrated by Elastic Protein-Based Polymers. J. Phys. Chem. B. 101, 11007-11028 (1997).
  2. Sallach, R. E., Conticello, V. P., Chaikof, E. L. Expression of a recombinant elastin-like protein in pichia pastoris. Biotechnology progress. 25, 1810-1818 (2009).
  3. Schipperus, R., Teeuwen, R. L., Werten, M. W., Eggink, G., de Wolf, F. A. Secreted production of an elastin-like polypeptide by Pichia pastoris. Appl Microbiol Biotechnol. 85, 293-301 (2009).
  4. Schipperus, R., Eggink, G., de Wolf, F. A. Secretion of elastin-like polypeptides with different transition temperatures by Pichia pastoris. Biotechnology progress. 28, 242-247 (2012).
  5. Herzog, R. W., Singh, N. K., Urry, D. W., Daniell, H. Expression of a synthetic protein-based polymer (elastomer) gene in Aspergillus nidulans. Appl Microbiol Biotechnol. 47, 368-372 (1997).
  6. Conley, A. J., Joensuu, J. J., Jevnikar, A. M., Menassa, R., Brandle, J. E. Optimization of elastin-like polypeptide fusions for expression and purification of recombinant proteins in plants. Biotechnology and bioengineering. 103, 562-573 (2009).
  7. Conrad, U., et al. ELPylated anti-human TNF therapeutic single-domain antibodies for prevention of lethal septic shock. Plant biotechnology journal. 9, 22-31 (2011).
  8. Kaldis, A., et al. High-level production of human interleukin-10 fusions in tobacco cell suspension cultures. Plant biotechnology journal. 11, 535-545 (2013).
  9. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3, 357-367 (2002).
  10. McDaniel, J. R., Mackay, J. A., Quiroz, F. G., Chilkoti, A. Recursive directional ligation by plasmid reconstruction allows rapid and seamless cloning of oligomeric genes. Biomacromolecules. 11, 944-952 (2010).
  11. Amiram, M., Quiroz, F. G., Callahan, D. J., Chilkoti, A. A highly parallel method for synthesizing DNA repeats enables the discovery of ‘smart’ protein polymers. Nat Mater. 10, 141-148 (2011).
  12. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Quantification of the effects of chain length and concentration on the thermal behavior of elastin-like polypeptides. Biomacromolecules. 5, 846-851 (2004).
  13. Urry, D. W., et al. Temperature of Polypeptide Inverse Temperature Transition Depends on Mean Residue Hydrophobicity. Journal of the American Chemical Society. 113, 4346-4348 (1991).
  14. Urry, D. W. The change in Gibbs free energy for hydrophobic association – Derivation and evaluation by means of inverse temperature transitions. Chem Phys Lett. 399, 177-183 (2004).
  15. Cho, Y., et al. Effects of Hofmeister anions on the phase transition temperature of elastin-like polypeptides. The journal of physical chemistry. B. 112, 13765-13771 (2008).
  16. Kim, B., Chilkoti, A. Allosteric actuation of inverse phase transition of a stimulus-responsive fusion polypeptide by ligand binding. J Am Chem Soc. 130, 17867-17873 (2008).
  17. Hassouneh, W., Nunalee, M. L., Shelton, M. C., Chilkoti, A. Calcium binding peptide motifs from calmodulin confer divalent ion selectivity to elastin-like polypeptides. Biomacromolecules. 14, 2347-2353 (2013).
  18. Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 62, 1479-1485 (2010).
  19. MacEwan, S. R., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides: biomedical applications of tunable biopolymers. Biopolymers. 94, 60-77 (2010).
  20. McDaniel, J. R., Callahan, D. J., Chilkoti, A. Drug delivery to solid tumors by elastin-like polypeptides. Adv Drug Deliv Rev. 62, 1456-1467 (2010).
  21. Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins. Curr Protoc Protein Sci. , (2010).
  22. Shamji, M. F., et al. Development and characterization of a fusion protein between thermally responsive elastin-like polypeptide and interleukin-1 receptor antagonist: sustained release of a local antiinflammatory therapeutic. Arthritis Rheum. 56, 3650-3661 (2007).
  23. Hassouneh, W., et al. Unexpected multivalent display of proteins by temperature triggered self-assembly of elastin-like polypeptide block copolymers. Biomacromolecules. 13, 1598-1605 (2012).
  24. Lan, D. M., et al. An improved nonchromatographic method for the purification of recombinant proteins using elastin-like polypeptide-tagged proteases. Analytical Biochemistry. 415, 200-202 (2011).
  25. Bellucci, J. J., Amiram, M., Bhattacharyya, J., McCafferty, D., Chilkoti, A. Three-in-one chromatography-free purification, tag removal, and site-specific modification of recombinant fusion proteins using sortase A and elastin-like polypeptides. Angewandte Chemie. 52, 3703-3708 (2013).
  26. Compton, S. J., Jones, C. G. Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. Anal Biochem. 151, 369-374 (1985).
  27. McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP. Protein expression and purification. 7, 51-57 (1996).
  28. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nat Biotechnol. 17, 1112-1115 (1999).
  29. McDaniel, J. R., et al. Self-assembly of thermally responsive nanoparticles of a genetically encoded peptide polymer by drug conjugation. Angewandte Chemie. 52, 1683-1687 (2013).

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Elastin-like PolypeptidesRecombinantNon-chromatographic PurificationLower Critical Solution TemperaturePhase TransitionCoacervationEscherichia ColiPeptide FusionProtein FusionBiosensingDrug DeliveryThermal Properties

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Citer Cet Article
MacEwan, S. R., Hassouneh, W., Chilkoti, A. Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli. J. Vis. Exp. (88), e51583, doi:10.3791/51583 (2014).
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