JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

Niet-chromatografische zuivering van recombinant elastine-achtige polypeptiden en hun Fusies met peptiden en eiwitten van<em> Escherichia coli</em

Published: June 09, 2014
doi:
10.3791/51583
, ,
1Department of Biomedical Engineering,Duke University, 2Research Triangle MRSEC,Duke University

Summary

Elastine-achtige polypeptiden zijn stimulus-responsieve biopolymeren met toepassingen variërend van recombinant eiwit zuivering naar drug delivery. Dit protocol beschrijft de zuivering en karakterisering van elastine-polypeptiden en hun peptide of eiwit fusies uit Escherichia coli met hun lagere kritische oplostemperatuur faseovergang gedrag als eenvoudig alternatief voor chromatografie.

Abstract

Elastine-achtige polypeptiden zijn repetitieve biopolymeren die een lagere kritische temperatuur van de oplossing faseovergang gedrag vertonen, bestaande als oplosbare unimers hieronder een karakteristieke overgang temperatuur en aggregeren in micronschaal coacervaten boven hun overgangstemperatuur. Het ontwerp van elastine-polypeptiden op genetisch niveau voor nauwkeurige controle van hun sequentie en lengte, die de thermische eigenschappen bepaalt. Elastine-polypeptiden worden gebruikt in een verscheidenheid aan toepassingen zoals biosensoren, weefseltechniek en drug delivery, waarbij de overgangstemperatuur en biopolymeer architectuur van het ELP kan worden afgestemd op de specifieke toepassing van belang. Bovendien is de onderste kritische oplostemperatuur faseovergang gedrag van elastine-polypeptiden maakt de zuivering door de thermische reactie, zodat hun selectieve gelering en resolubilization maakt de verwijdering van zowel oplosbare als onoplosbare verontreinigingens volgende expressie in Escherichia coli. Deze benadering kan worden gebruikt voor de zuivering van elastine polypeptiden alleen of als een middel voor zuivering peptide of eiwit fusies wanneer recombinante peptiden of proteïnen genetisch toegevoegd aan elastine polypeptide tags kunnen worden gezuiverd zonder chromatografie. Dit protocol beschrijft de zuivering van elastine-polypeptiden en hun peptide of eiwit fusies en bespreekt basiskarakterisering technieken om het thermisch gedrag van zuivere elastine polypeptide producten te beoordelen.

Introduction

Elastine polypeptiden (ELPs) zijn biopolymeren bestaande uit herhalende pentapeptide VPGXG waarbij X, gast residu elk aminozuur behalve proline. ELPs vertonen lage kritische oplostemperatuur (LCST) faseovergang gedrag, zodat een homogene ELP oplossing scheiden in twee fasen bij verhitting, waarbij de LCST, die gewoonlijk wordt genoemd de omgekeerde transitie temperatuur (t) in het ELP literatuur 1. De twee fasen bestaan ​​uit een zeer verdunde ELP globule fase en een ELP rijke sedimentfase. De ELP rijke sediment wordt gevormd op een kort tijdsbestek op aggregatie van de ELP-ketens in microscopisch kleine deeltjes die later samensmelten. Dit probleem doet zich over een bereik van enkele graden Celsius en is kenmerkend reversibel, een homogene oplossing wordt teruggewonnen bij terugkeer naar een temperatuur beneden het T t.

ELPs worden typisch gesynthetiseerd in Escherichia coli (E. coli) vam een ​​kunstmatig gen dat wordt geligeerd in een expressieplasmide. Dit plasmide wordt vervolgens getransformeerd in een E. coli-cellijn die optimaal is voor eiwitexpressie. Wij hebben uitsluitend de T7-lac pET vector voor expressie van een groot aantal ELPs in E. coli, hoewel andere expressiesystemen in gist 2-4, schimmels 5 en 6-8 planten zijn ook gebruikt door andere onderzoekers. Een aantal benaderingen bestaan ​​om genetisch construeren repetitieve ELP genen, waaronder recursieve directionele ligatie (RDL) 9, recursieve directionele ligatie door plasmide reconstructie (pre-RDL) 10, en overlappen uitbreiding rolling circle amplification (OERCA) 11. De mogelijkheid om ELPs ingenieur op genetisch niveau biedt de mogelijkheid om recombinant DNA technieken om ELPs maken met verschillende architecturen (bijv. monoblok, diblocks, triblokken, enz.), die verder kan worden toegevoegd met functionelepeptiden en eiwitten. Controle op genetisch niveau zorgt dat elke ELP wordt uitgedrukt met de exacte lengte en samenstelling bepaald door de genetische plasmidetemplaat, die perfect monodispers biopolymeer producten.

De thermische eigenschappen van elk ELP afhankelijk parameters inherent aan de biopolymeer zoals het molecuulgewicht (MW) en de sequentie, en extrinsieke factoren zoals de concentratie in oplossing en de aanwezigheid van andere cosolutes, zoals zouten. De lengte van de ELP 12 en zijn gast residusamenstelling 1, 13, 14 zijn twee orthogonale parameters ELP ontwerp dat kan worden gebruikt voor het regelen van de T t als gast hydrofobe residuen en langere ketenlengtes leiden tot lagere T t s, terwijl hydrofiele gast residuen en kortere keten lengtes resulteren in hogere T t s. ELP concentratie omgekeerd evenredig met T t als oplossingen greter ELP concentratie hebben een lagere T t s 12. Het type en de concentratie van zouten beïnvloeden de ELP T t, waarbij het ​​effect van zouten volgt de Hofmeister-serie 15. Kosmotropic anionen (Cl – en hoger op de Hofmeister-serie) verlagen de ELP T t en toenemende zoutconcentratie versterkt dit effect. Deze intrinsieke en extrinsieke parameters kunnen worden afgestemd op thermisch gedrag in een doeltemperatuur bereik dat nodig is voor een specifieke toepassing van een ELP vinden.

De stimulus-responsieve gedrag van ELPs is nuttig voor een breed scala aan toepassingen, waaronder biosensoren 16, 17, tissue engineering 18, en drug delivery 19, 20. Bovendien, wanneer ELPs gefuseerd aan peptiden of eiwitten op het genetisch niveau, kan de ELP dienen als een eenvoudige zuivering tag een goedkope batch werkwijze voor zuivering van recombinant pepgetijden of eiwitten die geen chromatografie 21 vereist. Wijziging van het zuiveringsproces ervoor dat de activiteit van het peptide of eiwit gefuseerd aan het ELP wordt gehandhaafd. Peptide of eiwit ELP fusies kunnen worden gezuiverd voor toepassingen waarbij de ELP tag nuttig 22, 23 of als alternatief, wanneer het vrije peptide of eiwit is nodig kan een protease herkenningsplaats ingevoegd tussen het peptide of eiwit en ELP. Verwijdering van de ELP-tag kan dan worden bereikt door digestie met gratis protease of een protease ELP fusie, waarbij de laatste zorgt voor de extra gemak van de verwerking als een laatste ronde van ELP zuivering kan de ELP-tag en protease ELP fusie scheiden van de doelpeptide of eiwit in een stap 24, 25. Het volgende protocol beschrijft de zuiveringsprocedure voor ELPs en peptide of eiwit ELP fusies door hun thermische eigenschappen en bespreekt basistechnieken voor het karakteriserende thermische reactie van ELP producten.

Protocol

1. ELP Expression Inoculeren 3 ml steriel Terrific Broth media met een DMSO voorraad of agar plaat kolonie van E. coli voor eiwitexpressie de gewenste ELP coderende plasmide onder controle van de T7-lac promotor. Voeg de juiste antibioticum en incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht (O / N) onder voortdurend schudden bij 200 rpm. Voeg 1 ml van de O / N kweek tot 1 l Terrific Broth steriele media in een 4-L kolf. Voeg de juiste antibioticum en incubeer bij 37 ° C gedurende 24 uur onder voortdurend schudden bij 200 rpm. OPMERKING: De "leaky" basislijn expressie gezien met de T7-lac promoter voldoende hoge expressie van vele ELPs wanneer de kweek wordt gedurende 24 uur. Toch kan een meer conventionele benadering worden gebruikt, waarbij eiwitexpressie verder geïnduceerd door de toevoeging van 0,2-1 mM isopropyl-bèta-D-thiogalactoside (IPTG) wanneer de optische dichtheid van de kweek bereikt 0.6. </li> Breng de kweek van de 4-L kolf aan een 1-L centrifugefles en centrifugeer bij 4 ° C gedurende 15 min bij 2000 x g. Verwijder het supernatant. OPMERKING: Als er meer dan 1 L van de cultuur wordt gekweekt kunnen worden gecondenseerd door het toevoegen van een liter van cultuur aan de pellet en herhalen van stap 1.3. Tot 2 L van cultuur kan worden samengevat in een enkele cel pellet. Resuspendeer de pellet in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), water of andere gewenste buffer 45 ml celsuspensie en overdracht bereiken een 50 ml conische buis. 2 ELP Zuivering:. Voorafgaande stappen en de eerste ronde van Inverse Transition Fietsen Ultrasone trillingen de celpellet geresuspendeerd in totaal 9 min in cycli van 10 seconden 'aan' en 20 sec 'uit bij een uitgangsvermogen van 85 W, terwijl het monster op ijs. Kort laat het monster afkoelen op ijs en herhaal de 9 min cyclus opnieuw. OPMERKING: Als de ELP is naar verwachting een zeer lage T t hebben </sub> kan de 'uit' interval verhoogd worden tot 40 seconden verwarming van de oplossing boven de T t voorkomen. Breng het lysaat in een 50 ml ronde bodem centrifugebuis. Voeg 2 ml 10% (w / v) polyethyleenimine (PEI) per liter cultuur en schudden om te mengen. OPMERKING: PEI is een positief geladen polymeer dat helpt bij de condensatie van negatief geladen genetische verontreinigingen. Sla deze stap niet uit te voeren als de ELP negatief geladen is, als de PEI kan ook condenseren en verwijder de ELP product. Centrifugeer bij 4 ° C gedurende 10 min bij 16.000 x g. Breng de bovenstaande om een ​​schone 50 ml ronde bodem centrifugebuis en de pellet gooi. Optionele "bak out" stap: Incubeer het monster bij 60 ° C gedurende 10 minuten om eiwitverontreinigingen denatureren en breng tot 4 ° C of ijs tot ELP volledig opnieuw opgelost. Centrifugeer het monster bij 4 ° C gedurende 10 min bij 16.000 x g. Breng de bovenstaande een clean 50 ml ronde bodem centrifugebuis en gooi de pellet. OPMERKING: deze stap niet uit als een peptide of eiwit wordt gefuseerd met de ELP en zal naar verwachting denatureren in de toestand van verhoogde warmte. Hierdoor kan de ELP overgang warmte irreversibel worden of kan de werking van het gefuseerde eenheid vernietigen. Induceren ELP overgang met de toevoeging van kristallijne NaCl (maximaal 3 M). Als alternatief kan natriumcitraat (niet meer dan 0,3 M) worden gebruikt voor ELPs die hogere T t s of lage opbrengsten hebben. OPMERKING: De oplossing moet helder draaien nadat het zout is opgelost, met vermelding van de fasescheiding van ELP uit de oplossing. Zeer hydrofiele ELPs hoge T t en kunnen een bepaalde verwarming nodig in combinatie met de toevoeging van zout aan de fasescheiding van het ETP in deze voorlopige inductie van de ELP overgang te induceren. Centrifugeer bij kamertemperatuur temperatue (RT) gedurende 10 min bij 16.000 xg (warm centrifugeren). OPMERKING: Een ELP pellet moet be waargenomen, waarvan de grootte afhankelijk is van de expressie opbrengst van de ELP. Dit ELP pellet kan op het eerste gezicht ondoorzichtig, maar na afkoeling het doorschijnende zal verschijnen en kan bruin van kleur zijn. De ELP pellet zal meer kleurloos worden als zuivering opbrengst en verontreinigende stoffen worden verwijderd. Verwijder het supernatant en voeg 1-5 ml gewenst buffer om de pellet. Resuspendeer de pellet door pipetteren of het instellen van de buis te roteren bij 4 ° C. OPMERKING: De vereiste hoeveelheid buffer zal afhangen van de grootte van de ELP pellet en dus de opbrengst van ELP-expressie, waarbij een voldoende hoeveelheid buffer worden toegevoegd om voor resolubilization van de ELP pellet. ELPs met een hoog gehalte aan cysteïne profiteren van zuivering in water met 10 mM Tris (2-carboxyethyl) fosfine hydrochloride (TCEP-HCl) bij een pH van 7 tot disulfide interacties met verontreinigende eiwitten elimineren. ELPs met hoge ladingsgehalte profiteren van zuivering bij een pH op hun lading te neutraliseren en verminderen electrostatic interacties met contaminerende eiwitten. Breng de geresuspendeerde ELP oplossing in 1 ml monsters in schone 1,5 ml microcentrifugebuizen. Centrifugeer bij 4 ° C gedurende 10 min bij 16.000 xg (koud centrifugeren). Een kleine pellet van onoplosbare verontreinigingen in acht worden genomen. Breng de bovenstaande om een ​​schone buis en de pellet gooi. . 3 ELP Zuivering: Latere Rondes van Inverse Transition Fietsen Induceren de ELP overgang met warmte en / of de toevoeging van NaCl. Monsters kunnen worden geïncubeerd op een verwarmingsblok of in een waterbad gedurende 15 minuten bij een temperatuur boven het T t. Indien echter de ELP gefuseerd aan een eiwit (die de toepassing van warmte) of de ELP een hoge T t die niet alleen kan worden bereikt met warmte, een 5 M NaCl-oplossing worden druppelsgewijs toegevoegd aan induceren ELP overgang. OPMERKING: De oplossing moet helder en geven aan de fasescheiding van ELP uit de oplossing. <li> Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 16.000 xg (warm draaien). Als warmte werd gebruikt in stap 3.1, voert deze centrifugeren bij een temperatuur boven die welke nodig was om de ELP overgang te induceren. Als NaCl alleen werd gebruikt in stap 3.1, voert u deze centrifugatiestap bij RT. OPMERKING: Een ELP pellet moeten worden nageleefd. Verwijder het supernatant, voeg 500-750 gl gewenste buffer en resuspendeer de pellet door pipetteren of het instellen van de buis te roteren bij 4 ° C. Centrifugeer bij 4 ° C gedurende 10 min bij 16.000 xg (koud centrifugeren). Een kleine pellet van onoplosbare verontreinigingen in acht worden genomen. Breng de bovenstaande om een ​​schone buis en de pellet gooi. Herhaal stap 3,1-3,5 totdat er geen verontreiniging pellet wordt waargenomen tijdens stap 3.4. 4. Na zuivering Processing (optioneel) Indien gewenst, dialyseer het monster tegen een geschikte buffer om overtollig zout uit de gezuiverde ELP oplossing te verwijderen. OPMERKING: ELPs worden gevriesdroogd moetgedialyseerd tegen DDH 2 OO / N bij 4 ° C. Desgewenst lyofiliseren ELP voor langdurige opslag door het bevriezen van de oplossing bij -80 ° C gedurende 30 min voor vriesdrogen O / N. OPMERKING: Lyofilisatie mag niet worden gebruikt voor ELPs met bijgevoegde eiwitten. Indien gewenst herstellen vrij peptide of eiwit uit een peptide of eiwit ELP fusie door het verwijderen van de ELP-tag: Digest de peptide of eiwit ELP fusie met gebiotinyleerd protease (zoals aanbevolen door de leverancier protease) of met een protease ELP fusie overeenkomt met de proteaseplaats genetisch gemaakt tussen het peptide of eiwit en ELP. Verwijder indien van toepassing de gebiotinyleerde protease behulp streptavidine gemodificeerde korrels (zoals aanbevolen door de protease leverancier). Induceren de overgang van de gekliefde ELP en / of protease ELP fusie door de druppelsgewijze toevoeging van een 5 M NaCl-oplossing. Centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min bij 16.000 x g. OPMERKING: Een ELP pellet moeten worden nageleefd. Gebruik de bovenstaande vloeistof en ELP pellet gooi. Dialyseer de supernatant met een gewenste buffer of gebruik een centrifugaal filter een bufferuitwisseling uitvoeren om de hoge zoutconcentratie van het zuivere peptide of eiwit-oplossing te verwijderen. Controleer de volledige splitsing van vrij peptide of eiwit van ELP tag door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE). 5 Karakterisering:. SDS-PAGE Bereid ELP monsters voor SDS-PAGE door 10 gl ELP verdund in water met 10 pl monsterbuffer die 2-mercaptoethanol. OPMERKING: 40 ug ELP vaak voldoende om de grootte en zuiverheid van het product te beoordelen ELP. Incubeer het monster bij 100 ° C gedurende 2 minuten en vervolgens laden op een polyacrylamidegel met een juiste grootte proteïneladder. Laat de gel bij 180 V totdat de kleurstof zal de onderkant van de gel (ongeveer 45 min). Vlekken op degel met een 0,5 M CuCl2-oplossing gedurende 5 minuten, terwijl schommelen. OPMERKING: ELPs zijn meestal niet gevisualiseerd door Coomassie Brilliant Blue vlek, zoals sommige ELP sequenties geen interactie met deze kleurstof. Coomassie Brilliant Blue interactie voornamelijk met arginine residuen en interageert zwak met andere basische residuen-histidine en lysine-en aromatische residuen-tryptofaan, tyrosine en fenylalanine 26. Aldus ELPs en peptide of eiwit ELP fusies kunnen worden gekleurd met Coomassie Brilliant Blue als hun primaire sequentie bevat een voldoende aantal van deze specifieke residuen. Controleer of de MW van de ELP band overeenkomt met die van de theoretische MW verwacht van de ELP-gen en dat er geen vreemde verontreinigingen banden aanwezig zijn. OPMERKING: Sommige ELPs migreren met een schijnbaar MW tot 20% hoger dan verwachte MW 9, 27. 6 Karakterisering:. Matrix-laserdesorptie /ionisatie Time-of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF-MS) Bereid een ELP-oplossing in 50% waterig acetonitril dat 0,1% trifluorazijnzuur ELP een concentratie van ongeveer 25 uM. OPMERKING: Deze oplossing moet vrij van zout, dus ELP moeten worden gedialyseerd tegen H 2 O na zuivering. Bereid een matrix oplossing van verzadigd sinapinezuur in 50% waterig acetonitril dat 0,1% trifluorazijnzuur. Voeg 1 ul van de ELP oplossing 9 pl modeloplossing een ELP concentratie van ongeveer 2,5 pmol / pl te bereiken. Opmerking: Dit mengsel kan verder worden verdund met matrixoplossing de MALDI-TOF signaal optimaliseren. Borg 1-2 ul van ELP-matrix mengsel op een metalen MALDI plaat en laat de plek volledig drogen. Verkrijgen 5-10 spectra met MALDI-TOF massa wordt de verhouding (m / z) opladen van de ELP en afleiden zijn gemeten MW. 7. Characterization: Temperatuur-geprogrammeerde turbidimetrie en dynamische lichtverstrooiing Bepaal de T t van de ELP door temperatuurgeprogrammeerde turbidimetrie: Bereid een verdunningsreeks (bijv. 5-100 uM) van ELP oplossingen in de gewenste buffer. Met een temperatuurgeregelde UV-Vis spectrofotometer meet de optische dichtheid (OD) bij 350 nm over een bereik van temperaturen (bijvoorbeeld 20-80 ° C) met een opwarmsnelheid van 1 ° C / min. OPMERKING: Als er geen toename van de OD wordt gezien de T t kan de maximumgrens van het instrument overschrijden. De blijkbare niet kan worden verminderd door toevoeging van NaCl. Ga naar 1 M NaCl en verhogen in stappen van 0,5 M tot ELP overgang wordt gedetecteerd binnen een meetbare temperatuurbereik. Controleer omkeerbaarheid van de ELP overgang door meting van de afname van OD hetzelfde bereik van temperatuur bij een afkoelsnelheid van 1 ° C / min. Bepaal de T t van de homopolymeer ELP door het identificeren van het buigpunt van de troebelheid profiel (OD uitgezet tegen de temperatuur). Opmerking: Deze temperatuur kan gemakkelijk worden bepaald uit de afgeleide van de OD curve waar de temperatuur overeenkomt met het maximum van het derivaat wordt gedefinieerd als T t. Meer complexe ELP architecturen zal ingewikkelder troebelheid profielen geven en moet verder worden geanalyseerd zoals beschreven in paragraaf 7.2. Aanvullende karakterisering van ELPs die meer complexe thermische eigenschappen (bijvoorbeeld, ELP diblokcopolymeren die zichzelf assembleren tot bolvormige micellen) weer wordt bereikt door dynamische lichtverstrooiing (DLS): Bereid een ELP oplossing in de gewenste buffer en passeren het monster door een filter met een 20-450 nm poriegrootte. OPMERKING: De keuze van filterporiegrootte zal afhangen van de aanwezigheid, de grootte en de stabiliteit van een ELP samenstellingen in oplossing. De kleinste haalbare filterporiegrootte voorkeur om verontreinigingen zoals eliminerenstof, dat de kwaliteit van DLS metingen verminderen. Een grotere filterporiegrootte moet worden gebruikt wanneer aanzienlijke weerstand wordt ondervonden bij het passeren van een ELP oplossing door kleinere filter poriën. Meet de hydrodynamische straal (RH) over een bereik van temperaturen die correspondeert met een van belang die in de troebelheid profiel. OPMERKING: ELP unimers hebben meestal een R H <10 nm, nanodeeltje samenstellingen hebben een R H ~ 20-100 nm, en aggregaten hebben een R H> 500 nm. Elke toename RH moet overeenkomen met een toename OD bij 350 nm gemeten met UV-Vis spectrofotometrie als functie van de temperatuur, die evenredig is aan de grootte van het deeltje.

Representative Results

Hier beschrijven we representatieve resultaten voor de zuivering en karakterisering van een ELP homopolymeer en een ELP diblokcopolymeer. Na 24 uur van expressie in E. coli worden cellen verzameld door centrifugatie en gelyseerd door sonicatie. Typisch, een subtiele kleurverandering optreedt na sonicatie bevestigt voldoende cellyse (Figuur 1A). Na de toevoeging van PEI worden genomische componenten en celresten door centrifugatie verzameld, scheiden van een grote pellet van onoplosbare verontreinigingen uit de oplosbare ELP in het supernatant (Figuur 1B). ELP wordt verder gezuiverd door omgekeerde transitie fietsen (ITC), die de LCST gedrag exploiteert de ELP scheiden van zowel oplosbare als onoplosbare verontreinigingen (figuur 2) 28. De faseovergang van het ETP wordt veroorzaakt door de toevoeging van warmte en / of zout. Centrifugeren resulteert in de vorming van een pellet op de bodem van de buis die bestaat uit een ELPnd sommige onoplosbare verontreinigingen (figuur 1C). Deze stap-aangeduid als een hot spin-teruggooi oplosbare verontreinigingen in het supernatant terwijl de ELP pellet wordt bewaard en opnieuw gesuspendeerd in koude buffer. De hersolubiliseerde ELP weer bij 4 ° C gecentrifugeerd Deze stap-noemde koud rotatie-discards de pellet van onoplosbare verontreinigingen terwijl de supernatant die oplosbare ELP behouden. Herhaling van de cyclus van afwisselend heet en koud spins verhoogt de zuiverheid van het ELP, maar ten koste van enigszins afnemende opbrengst, als restafval ELP verloren tijdens elke ITC door in centrifugebuizen en pipetpunten. Succesvolle zuivering van ELPs en peptide of proteïne ELP fusies wordt bevestigd door SDS-PAGE. Kleine monsters genomen tijdens het zuiveringsproces tonen de geleidelijke zuivering van ELP van E. coli lysaat. ELP overexpressie wordt gebracht in de ruwe E. coli lysaat en contaminanten verminderen with opeenvolgende ronden van ITC (figuur 3). Gezuiverd ELP verschijnt als een enkele band in de buurt van de voorspelde theoretische MW. De ELP T t wordt gekenmerkt door een temperatuur-geprogrammeerde turbidimetrie. De troebelheid profiel van een ELP homopolymeer vertoont een sterke stijging van de OD bij 350 nm (ongeveer 2,0 eenheden boven de basislijn voor een ELP concentratie van 25 uM) (Figuur 4A). Koeling troebelheid scans bevestigen reversibele aard van de ELP overgang als OD terugkeert naar basislijn als de temperatuur onder de T t (figuur 4B) wordt verlaagd. ELP diblokcopolymeren vertonen een complexere troebelheid profiel in vergelijking met homopolymeer ELPs. De OD typisch eerst toeneemt tot 0,1-0,5 eenheden boven basislijn, waarna de OD sterk toe tot 2,0 eenheden boven de basislijn (Figuur 5A). DLS metingen geven informaties verandering RH met betrekking tot de temperatuur, co rroborating de informatie verkregen uit de troebelheid profiel (Figuur 5B). Figuur 1. Voorlopige ELP zuivering. Na 24 uur van meningsuiting, E. coli cellen verzameld door centrifugatie en geresuspendeerd in PBS. is A) cellen gelyseerd door sonicatie, die gepaard gaat met een subtiele kleurverandering zodat het lysaat donkerder na sonicatie. B) Na toevoeging van PEI aan DNA verontreinigingen condenseren, het lysaat is gecentrifugeerd en een grote pellet van onoplosbare brokstukken afgescheiden oplosbare ELP in het supernatant. C) De ELP overgang wordt geïnduceerd met toevoeging van warmte en / of zout en centrifugeren vormt een doorschijnende ELP pellet.ank "> Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 2. Inverse overgang fietsen. ELP gebeurt door de LCST gedrag van zowel oplosbare en onoplosbare verontreinigingen gezuiverd. Vanaf de ELP-rijke lysaat (1) ELP overgang geïnduceerd met toevoeging van warmte en / of zout en ELP wordt afgescheiden door centrifugeren (warm centrifugeren) (2). De ELP pellet wordt behouden (3a), terwijl de bovenstaande vloeistof die oplosbare verontreinigingen wordt weggegooid (3b). De ELP wordt geresuspendeerd in koude buffer (4) en opnieuw gecentrifugeerd bij 4 ° C (koud centrifugeren) (5). De pellet bevat onoplosbare verontreinigingen wordt weggegooid (6a), terwijl de bovenstaande vloeistof die oplosbare ELP wordt behouden (6b). Cycli van afwisselend heet en koud spins worden herhaald tot de gewenste zuiverheid is bereikt, zoals bepaaldSDS-PAGE. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 3. SDS-PAGE analyse van ELP zuiveringsproducten. Succesvolle zuivering van een ELP wordt bevestigd door SDS-PAGE. Overexpressie ELP is duidelijk zichtbaar in de ruwe E. coli lysaat na sonificeren (2). Na de toevoeging van PEI en centrifugeren het oplosbare ELP grotendeels vastgehouden in het supernatant (3), hoewel sommige ELP is verloren in de weggegooid pellet van onoplosbare verontreinigingen (4). Supernatant na de eerste hete rotatie bevat significante niveaus van oplosbare verontreinigingen (5). Supernatant na de eerste koude rotatie geeft een goede scheiding van ELP van onoplosbare verontreinigingen (6). Extra cycli warm (7) en coude spins (8) Verwijderen residuele oplosbare en onoplosbare verontreinigingen, respectievelijk tot de uiteindelijke warme (9) en koud centrifugeren (10) supernatanten vertonen geen vreemde verontreinigingen banden bevestigt bevredigende zuiverheid van het ELP product. Dit ELP homopolymeer, met een opeenvolging van SKGPG-(VGVPG) 80-Y, heeft een verwachte molecuulgewicht van 33,37 kDa. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 4. Karakterisering van ELP homopolymeer van temperatuur geprogrammeerde turbidimetrie. Het ELP T t wordt bepaald door het monitoren van de OD bij 350 nm terwijl het verhogen van de temperatuur met een snelheid van 1 ° C / min. A) ELP homopolymeren vertonen een sterke stijging OD dat defines hun T t bij een bepaalde concentratie. B) De omkeerbaarheid van de ELP overgang wordt gecontroleerd door het bewaken van de OD bij 350 nm van een 25 μ M oplossing, terwijl het verlagen van de temperatuur, waarbij de omkeerbaarheid wordt bevestigd door de terugkeer van de OD van de uitgangswaarde. Deze ELP homopolymeer heeft de sequentie SKGPG-(VGVPG) 80-Y. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 5. Karakterisering van ELP diblokcopolymeer door temperatuurgeprogrammeerde turbidimetrie en dynamische lichtverstrooiing. ELPs dat nano-schaal zelf-assemblage ondergaan, zoals ELP diblokcopolymeren die zichzelf assembleren tot sferische micellen, vertonen meer complexe troebelheid profielen. <stronG> A) Matig toename OD geeft de overgang van unimers micellen, voorafgaand aan een snelle toename OD dat volledige samenvoeging van de ELP geeft in micronschaal aggregaten. B) DLS metingen bevestigen gedrag afgeleid uit de troebelheid profiel voor een oplossing bij 25 uM door informatie over de verandering in RH met de temperatuur. Hier de ELP Unimer heeft een R H ~ 8 nm en de micel heeft een R H ~ 25 nm. Dit ELP diblokcopolymeer heeft de sequentie GCGWPG-(VGVPG) 60 – (AGVPGGGVPG) 30-PGGS. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussion

ELPs bieden een goedkope en-chromatografie vrij middel van zuivering door exploitatie van hun stimulus-responsieve fasegedrag. Deze benadering maakt gebruik van het LCST gedrag van ELPs en peptide of proteïne ELP fusies aan zowel oplosbare en onoplosbare verontreinigingen te verwijderen na expressie van genetisch gecodeerde ELPs in E. coli. Deze eenvoudige zuivering kan worden gebruikt ELPs produceren voor verschillende toepassingen of kan worden benut voor de zuivering van recombinante peptiden of eiwitten, waarin de ELP kan fungeren als een zuivering tag die kunnen worden verwijderd met post-zuivering processing.

ELP zuivering omvat voorbereidende stappen te lyseren E. coli en verwijder genomische en onoplosbare celresten van het ruwe lysaat kweek (figuur 1), gevolgd door verwijdering van resterend oplosbare en onoplosbare verontreinigingen door ITC (figuur 2). Centrifugeren na het activeren van de ELP overgang door de extratie van warmte of zout scheidt ELP oplosbare verontreinigingen in de bovenstaande vloeistof in een stap aangeduid als een hete rotatie. Na resolubilizing het ETP wordt de oplossing opnieuw bij een temperatuur beneden de T t gecentrifugeerd om de onoplosbare verontreinigingen pellet verwijderd, in een stap aangeduid als een koud centrifugeren. Afwisselend warme en koude spins verbetert de zuiverheid van de ELP-oplossing met elke cyclus, op een kleine prijs te geven. Zuivering opbrengsten variëren naargelang de ELP T t, lengte en gefuseerde peptiden of eiwitten. Meestal is dit protocol levert 100 mg gezuiverd ELP per liter E. coli-cultuur, maar opbrengsten kunnen oplopen tot 500 mg / L. De uiteindelijke zuiverheid van het ELP product wordt bevestigd door SDS-PAGE (Figuur 3). De MW van het gezuiverde ELP moeten nauw overeenkomen met de theoretische MW gecodeerd door de ELP-gen. Echter, sommige ELPs migreren in SDS-PAGE met een schijnbaar MW tot 20% hoger dan verwachte MW 9, 27. Meer nauwkeurige analyse van de ELPMW kan door MALDI-TOF-MS, die ook aanvullende informatie over de zuiverheid van het product ELP met orthogonale analytische technieken, zoals hoge prestatie vloeistofchromatografie (HPLC).

Na zuivering wordt het ELP T t gemeten door temperatuur-geprogrammeerde turbidimetrie. Deze techniek houdt de OD van een ELP oplossing terwijl de temperatuur wordt verhoogd. De T t is concentratieafhankelijke dus is het raadzaam om een concentratiereeks de beoogde toepassing van het ETP relevante kenmerken. Voor ELP HOMOPOLYMEREN de troebelheid profiel vertoont een sterke stijging die overeenkomt met de ELP overgang van Unimer tot micronschaal aggregaten (Figuur 4A). De T t is gedefinieerd als de temperatuur overeenkomt met het buigpunt in de troebelheid profiel nauwkeurig bepaald als het maximum van de eerste afgeleide van de OD met de temperatuur. De omkeerbaarheid van deELP faseovergang wordt bevestigd door een daling OD tot basislijn als de temperatuur onder de T t (figuur 4B) wordt verlaagd. De troebelheid profiel met stijgende en dalende temperatuur hellingen zullen verschillen in grootte en kinetiek vanwege de afwikkeling van ELP coacervaten en variabele hysterese van ELP resolubilization. Peptide of eiwit ELP fusies die gelijk vertonen LCST gedrag deze manier, waar het peptide of eiwit gefuseerd aan het ELP invloed op de T t. Voor eiwit-fusies ELP overgang omkeerbaar beneden de smelttemperatuur van het eiwit. Terwijl temperatuurgeprogrammeerde troebelheid is een uitstekende werkwijze voor de initiële thermische karakterisering van ELP producten, alternatieve technieken, zoals differentiële scanning calorimetrie (DSC), kunnen ook worden gebruikt voor het meten van de ELP T t.

ELPs met complexere architecturen vertonen ingewikkelder thermische gedrag dat ook kan worden gekarakteriseerd door de temperatuur-prograMMED turbidimetrie. ELP diblokcopolymeren, bijvoorbeeld, vertonen een karakteristieke troebelheid profiel overeenkomt met de temperatuur geactiveerd zelfassemblage sferische micellen hun kritische temperatuur micellering. Voor dergelijke ELP diblokcopolymeren de OD verhoogt meestal eerst 0,1-0,5 eenheden boven de uitgangswaarde met vermelding van de overgang van unimers tot micellen, waarna een sterke stijging van de OD (tot 2,0 eenheden boven de uitgangswaarde) bij een hogere temperatuur geeft de vorming van micronschaal aggregaten (figuur 5A). Aanvullende informatie over temperatuur veroorzaakt zelf-geassembleerde ELP structuren wordt verkregen met DLS, een techniek die de R H van ELP assemblages meet in oplossing. Veranderingen in R H nauw eens met veranderingen in de OD gemeten met turbidimetrie (Figuur 5B). ELP unimers vertonen typisch een R H <10 nm, terwijl nanodeeltjes samenstellingen vertonen een R H ~ 20-100 nm en aggregaten vertonen een R H </sub >> 500 nm. Aanvullende informatie over zelf-geassembleerde ELP nanodeeltjes, zoals aggregatiegetal en morfologie kan worden verkregen door statische lichtverstrooiing of cryogene transmissie elektronenmicroscopie 17, 23, 29.

Vanwege de tunability van ELP thermische eigenschappen, is een reeks van T t s verkregen door verschillende ELP ontwerpen. Het is belangrijk om in gedachten te houden dat de inherente T t de optimalisatie van de zuivering protocol voor elk ELP, waar extreem lage of hoge T t s de meest wijziging van deze standaard protocol vereist zal beïnvloeden. ELPs met extreem hoge kritische temperaturen kunnen geschikt zijn voor zuivering bij deze benadering. Als het ontwerp van nieuwe ELPs en peptide of eiwit ELP fusies de thermische reactie van de ELP in gevaar kunnen brengen, kan een eenvoudige histidine-tag worden opgenomen voor alternatieve zuivering door geïmmobiliseerde metaal affiniteitschromatografie. Bovendien,kenmerken van de ELP-sequentie kan wijziging van dit protocol vereist indien de gast residu wordt opgeladen. Manipulatie van de pH kan worden gebruikt als een methode om de totale lading van het ETP in een poging om elektrostatische interacties met verontreinigingen elimineren 17 veranderen. Bovendien is dit protocol is geschikt voor de bijzondere omstandigheid van ELP fusies met peptiden en eiwitten wanneer passende maatregelen worden genomen om ervoor te zorgen het zuiveringsproces niet de activiteit van de gefuseerde groep verstoren. Aantekeningen over de hele protocol op deze wijzigingen dienen om direct de zuivering van ELPs dat deze uitdagingen kan opleveren met betrekking tot T t, lading, of fusie betreft.

De zuivering van ELPs door hun LCST gedrag biedt een eenvoudige en chromatografie vrij benadering de meeste ELPs en peptide of proteïne ELP fusies tot expressie gebracht in E. zuiveren coli. Het protocol hier samengevat maakt zuivering of ELPs in een enkele dag met behulp van apparatuur die gemeenschappelijk is voor de meeste biologische laboratoria. Het gemak van zuivering van ELPs en hun fusies zullen, naar wij hopen, moedigen een steeds groeiende diversiteit van ELP ontwerpen voor nieuwe toepassingen in de materiaalkunde, biotechnologie en geneeskunde.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de NSF Research Triangle MRSEC (DMR-1121107).

Materials

pET-24a(+)
pET-25b(+)		 Novagen 69749-3
69753-3		 T7-lac expression vectors with resistance to kanamycin (pET-24) or ampicillin (pET-25).
Ultra BL21 (DE3) competent cells Edge BioSystems 45363 Competent E. coli for recombinant protein expression.
Terrific Broth (TB) Dry Powder Growth Media MO BIO Laboratories 12105 Media is reconstituted in DI H2O and autoclaved before use.
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) Gold Biotechnology I2481C IPTG is reconstituted in DI H2O, sterile filtered, and added to cultures to induce enhanced expression.
Phosphate buffered saline (PBS) tablet Calbiochem 524650 These PBS tablets, when dissolved in 1 L of DI H2O, yield a 10 mM phosphate buffer with 140 mM NaCl, and 3 mM KCl with a pH of 7.4 at 25 °C.
Polyethyleneimine (PEI) Solution (~50% w/v) MP Biomedicals 195444 PEI is prepared as a 10% (w/v) solution in deionized H2O.
Nalgene Oak Ridge high-speed centrifuge tubes, 50 mL Thermo Scientific 3138-0050 These round-bottom tubes withstand high-speed centrifugation of 30-50 ml.
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP-HCl) Thermo Scientific 20491 A stock solution of TCEP-HCl is prepared at 100 mM in DI H2O and adjusted to pH 7.0. For ELPs with a high cysteine content the stock solution of this reducing agent is added to the ELP pellet to reach 10 mM in H2O.
Ready Gel Tris-HCL gel, 4-20% linear gradient polyacrylamide gel, 10 well, 30 μl Bio-Rad Laboratories 161-1105 These linear gradient gels offer good visualization of ELPs with a range of MWs.
Cupric chloride dihydrate (CuCl2-2H2O) Fisher Scientific C454-500 A filtered 0.5 M solution is prepared for negative staining of Tris-HCL polyacrylamide gels.
Anotop 10 syringe filter:
0.02 μm
0.1 μm
0.2 μm		 Whatman 6809-1002
6809-1012
6809-1022		 These 10 mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes for DLS measurements.
Millex-HV filter:
0.45 μm		 EMD Millipore SLHVX13NK These 13 mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes of solutions with large nanoparticle assemblies for DLS measurements.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Urry, D. W. Physical Chemistry of Biological Free Energy Transduction As Demonstrated by Elastic Protein-Based Polymers. J. Phys. Chem. B. 101, 11007-11028 (1997).
  2. Sallach, R. E., Conticello, V. P., Chaikof, E. L. Expression of a recombinant elastin-like protein in pichia pastoris. Biotechnology progress. 25, 1810-1818 (2009).
  3. Schipperus, R., Teeuwen, R. L., Werten, M. W., Eggink, G., de Wolf, F. A. Secreted production of an elastin-like polypeptide by Pichia pastoris. Appl Microbiol Biotechnol. 85, 293-301 (2009).
  4. Schipperus, R., Eggink, G., de Wolf, F. A. Secretion of elastin-like polypeptides with different transition temperatures by Pichia pastoris. Biotechnology progress. 28, 242-247 (2012).
  5. Herzog, R. W., Singh, N. K., Urry, D. W., Daniell, H. Expression of a synthetic protein-based polymer (elastomer) gene in Aspergillus nidulans. Appl Microbiol Biotechnol. 47, 368-372 (1997).
  6. Conley, A. J., Joensuu, J. J., Jevnikar, A. M., Menassa, R., Brandle, J. E. Optimization of elastin-like polypeptide fusions for expression and purification of recombinant proteins in plants. Biotechnology and bioengineering. 103, 562-573 (2009).
  7. Conrad, U., et al. ELPylated anti-human TNF therapeutic single-domain antibodies for prevention of lethal septic shock. Plant biotechnology journal. 9, 22-31 (2011).
  8. Kaldis, A., et al. High-level production of human interleukin-10 fusions in tobacco cell suspension cultures. Plant biotechnology journal. 11, 535-545 (2013).
  9. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3, 357-367 (2002).
  10. McDaniel, J. R., Mackay, J. A., Quiroz, F. G., Chilkoti, A. Recursive directional ligation by plasmid reconstruction allows rapid and seamless cloning of oligomeric genes. Biomacromolecules. 11, 944-952 (2010).
  11. Amiram, M., Quiroz, F. G., Callahan, D. J., Chilkoti, A. A highly parallel method for synthesizing DNA repeats enables the discovery of ‘smart’ protein polymers. Nat Mater. 10, 141-148 (2011).
  12. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Quantification of the effects of chain length and concentration on the thermal behavior of elastin-like polypeptides. Biomacromolecules. 5, 846-851 (2004).
  13. Urry, D. W., et al. Temperature of Polypeptide Inverse Temperature Transition Depends on Mean Residue Hydrophobicity. Journal of the American Chemical Society. 113, 4346-4348 (1991).
  14. Urry, D. W. The change in Gibbs free energy for hydrophobic association – Derivation and evaluation by means of inverse temperature transitions. Chem Phys Lett. 399, 177-183 (2004).
  15. Cho, Y., et al. Effects of Hofmeister anions on the phase transition temperature of elastin-like polypeptides. The journal of physical chemistry. B. 112, 13765-13771 (2008).
  16. Kim, B., Chilkoti, A. Allosteric actuation of inverse phase transition of a stimulus-responsive fusion polypeptide by ligand binding. J Am Chem Soc. 130, 17867-17873 (2008).
  17. Hassouneh, W., Nunalee, M. L., Shelton, M. C., Chilkoti, A. Calcium binding peptide motifs from calmodulin confer divalent ion selectivity to elastin-like polypeptides. Biomacromolecules. 14, 2347-2353 (2013).
  18. Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 62, 1479-1485 (2010).
  19. MacEwan, S. R., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides: biomedical applications of tunable biopolymers. Biopolymers. 94, 60-77 (2010).
  20. McDaniel, J. R., Callahan, D. J., Chilkoti, A. Drug delivery to solid tumors by elastin-like polypeptides. Adv Drug Deliv Rev. 62, 1456-1467 (2010).
  21. Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins. Curr Protoc Protein Sci. , (2010).
  22. Shamji, M. F., et al. Development and characterization of a fusion protein between thermally responsive elastin-like polypeptide and interleukin-1 receptor antagonist: sustained release of a local antiinflammatory therapeutic. Arthritis Rheum. 56, 3650-3661 (2007).
  23. Hassouneh, W., et al. Unexpected multivalent display of proteins by temperature triggered self-assembly of elastin-like polypeptide block copolymers. Biomacromolecules. 13, 1598-1605 (2012).
  24. Lan, D. M., et al. An improved nonchromatographic method for the purification of recombinant proteins using elastin-like polypeptide-tagged proteases. Analytical Biochemistry. 415, 200-202 (2011).
  25. Bellucci, J. J., Amiram, M., Bhattacharyya, J., McCafferty, D., Chilkoti, A. Three-in-one chromatography-free purification, tag removal, and site-specific modification of recombinant fusion proteins using sortase A and elastin-like polypeptides. Angewandte Chemie. 52, 3703-3708 (2013).
  26. Compton, S. J., Jones, C. G. Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. Anal Biochem. 151, 369-374 (1985).
  27. McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP. Protein expression and purification. 7, 51-57 (1996).
  28. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nat Biotechnol. 17, 1112-1115 (1999).
  29. McDaniel, J. R., et al. Self-assembly of thermally responsive nanoparticles of a genetically encoded peptide polymer by drug conjugation. Angewandte Chemie. 52, 1683-1687 (2013).

Tags

Elastin-like PolypeptidesRecombinantNon-chromatographic PurificationLower Critical Solution TemperaturePhase TransitionCoacervationEscherichia ColiPeptide FusionProtein FusionBiosensingDrug DeliveryThermal Properties

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
MacEwan, S. R., Hassouneh, W., Chilkoti, A. Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli. J. Vis. Exp. (88), e51583, doi:10.3791/51583 (2014).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image