重组弹性蛋白样多肽及其融合物与从肽和蛋白质非色谱纯化<em>大肠杆菌</em

1，ELP表达接种3毫升无菌极品肉汤媒体与DMSO股票或大肠杆菌的琼脂平板上菌落大肠杆菌适合包含下的T7-lac启动子的控制所需的ELP-质粒编码蛋 ​​白的表达。添加适当的抗生素和连续200rpm振荡孵育37℃过夜（O / N）。 加入1 ml的O / N培养1升的4-L烧瓶极品肉汤的无菌介质中。添加适当的抗生素和孵化，在37℃下24小时连续200rpm振荡。注：看到与T7-lac启动子的“漏”基线表达足以让许多电子学习产品的高水平表达，如果这样的文化培养24小时。然而，更传统的方法都可以使用，其特征在于：蛋白质的表达进一步通过加入0.2-1 1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，当培养物的光密度达到0.6。 </li> 从4-L烧瓶中转移到培养1升的离心瓶中并离心机在4℃下进行15分钟，在2000×g下。 弃上清。注：如果超过1升培养物生长，他们可以通过添加另一个升培养物的沉淀，并重复步骤1.3中冷凝。高达2升培养物可以被浓缩成单个细胞沉淀。 悬浮于磷酸盐缓冲盐水（PBS），水，或其它所需的缓冲颗粒达到45 ml的细胞悬浮液，并转移到50毫升锥形管中。 2 ELP净化：预备步骤和第一轮逆转换的自行车超声处理的悬浮细胞沉淀，总共9分钟的“上”10秒和20秒“关断”时的85瓦特的输出功率的周期，同时保持样品在冰上。简单地说让样品冷却冰，然后重复9分钟循环一次。注意：如果ELP预计将有一个非常低的T T </子>“关断”的时间间隔可以增加至40秒，以避免上述的T T溶液的加热。 裂解液转移至50毫升圆底离心管中。 加入2毫升10％（W / V）聚乙烯亚胺（PEI）为每公升文化，并摇匀。注意：PEI是带正电荷的聚合物，其有助于在带负电荷的遗传污染物的缩合。不要执行此步骤如果ELP的负电荷，由于PEI还可以凝结，取出ELP产品。 离心机在16,000 xg 4℃，10分钟。 将上清转移至50 mL的干净圆底离心管中，弃沉淀。 可选的“烘烤”的步骤：孵育样品在60°C下10分钟以变性蛋白污染物，然后转移到4℃或冰上，直到ELP完全resolubilized。离心机的样品在以16,000×g下4℃放置10分钟。将上清转移到CLEAN50毫升圆底离心管中，弃去沉淀。注意：如果肽或蛋白融合到电子学习产品，并有望在高架热条件变性不要执行此步骤。这可能会导致对ELP过渡成为热不可逆的或可能破坏稠合基团的活性。 诱导与另外结晶氯化钠（不超过3公尺）的ELP过渡。可替换地，柠檬酸钠（不超过0.3 M），可用于具有较高的T T S或低收率电子学习。注意： 该解决方案应该把混浊一旦盐溶解，说明ELP从溶液相分离。具有高T T的甚亲水电子学习产品可能需要一定程度的加热，与加成盐的组合，诱导对ELP的相分离在ELP过渡的这一初步的诱导。 离心机在室温temperatue（RT）下以16,000×g离心（热自旋）10分钟。注意：一个ELP颗粒B应该要Ë观察，其大小取决于ELP的表达产量。这ELP颗粒可能会在第一次出现不透明的，但冷却后会出现半透明的，可能是棕色的。对ELP颗粒将变得更加无色的净化所得款项及污染物去除。 弃去上清液，加入1-5毫升所需的缓冲区来沉淀。通过移液重悬沉淀或将管在4℃下旋转 注意：缓冲器的所需体积将取决于ELP粒料的大小，从而ELP的表达，可在其中添加缓冲足够量以允许所述ELP粒料再增的产率。电子学习与纯化水中的10mM的Tris（2 – 羧乙基）膦盐酸盐（TCEP-HCl中）在pH为7，以消除污染的蛋白质二硫键相互作用高半胱氨酸含量的好处。电子学习产品与净化的pH值调节高电荷含量的利益，以中和其电荷和减少元素ctrostatic互动与杂蛋白。 转移1毫升分装再悬浮的ELP溶液倒入洁净的1.5 ml离心管中。 离心机在4℃下在16,000 XG（冷旋）10分钟。小颗粒不溶性杂质应得到遵守。 将上清转移到一个干净的试管，弃去沉淀。 3，ELP净化：反后过渡骑自行车的回合诱导用热和/或添加NaCl对ELP过渡。样品可以培养在热块或在水浴中15分钟，在上面的T T的温度。然而，如果对ELP融合到蛋白质（排除使用热），或者如果ELP具有高T T，不能用热单独达到的NaCl 5M的溶液可以逐滴加入以诱导ELP过渡。注：该解决方案应该转多云，表明ELP从溶液相分离。 <li>离心机在16,000 XG（热旋）10分钟。如果热量在步骤3.1中使用，上面的这是需要引起对ELP转变的温度下进行这种离心步骤。如果单独的NaCl在步骤3.1中使用，在室温下执行该离心步骤。注：ELP颗粒应得到遵守。 弃去上清液，加入500-750微升所需的缓冲液中，并通过移液重悬沉淀或将管在4℃下旋转离心机在4℃下在16,000 XG（冷旋）10分钟。小颗粒不溶性杂质应得到遵守。 将上清转移到一个干净的试管，弃去沉淀。 直到没有杂质沉淀在步骤3.4观察重复步骤3.1至3.5。 4，后期净化处理（可选） 如果需要的话，透析样品对一个合适的缓冲液，以从纯化ELP溶液除去过量的盐。注意：电子学习产品被冷冻干燥应透析双蒸二 OO / N在4°C。 如果需要，可通过冷冻干燥的O / N。冷冻前的溶液在-80℃下30分钟的冷冻干燥ELP用于长期存储注意：冻干不应被用于电子学习与所附的蛋白质。 如果需要，可通过除去ELP标签回收游离肽或蛋白由肽或蛋白质的ELP融合： 消化的肽或蛋白质的ELP融合与生物素化的蛋白酶（所推荐的蛋白酶供应商）或与相对应的蛋白酶位点的肽或蛋白与ELP之间的基因而设计的蛋白酶ELP融合。 如果适用的话，用链亲和素修饰的磁珠（所推荐的蛋白酶供应商）除去生物素化的蛋白酶。 诱导裂解ELP和/或蛋白酶ELP融合了逐滴加入的5M NaCl溶液的过渡。 离心机在室温下以16,000×g的10分钟。注：ELP颗粒应得到遵守。 收集上清液并弃去沉淀ELP。透析的上清液对所期望的缓冲液，或者使用离心过滤器，以便进行缓冲液交换，从纯肽或蛋白质溶液中除去高浓度的盐。 确认来自ELP标签通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）游离肽或蛋白质的完全切割。 5特性：SDS-PAGE 通过混合10微升ELP的稀释在水中用10微升含2 – 巯基乙醇的样品缓冲液中制备的ELP样品进行SDS-PAGE。注：40微克ELP的往往是足够的，以评估对ELP产品的大小和纯度。 孵育样品在100℃下持续2分钟，然后加载到聚丙烯酰胺凝胶连同一个适当大小的蛋白质的阶梯。 运行该凝胶在180 V开始，染料接近凝胶（约45分钟）的底部。 染色凝胶用5分钟0.5M的氯化铜溶液，同时摇动。注意： 电子学习产品通常不被考马斯亮蓝染色显现，一些ELP序列不具有这种染料相互作用。考马斯亮蓝主要交互的精氨酸残基和弱酸和其它碱性氨基酸残基，组氨酸和赖氨酸-和芳族残基，色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸26交互。因而电子学习和肽或蛋白ELP融合物可染色用考马斯亮蓝仅当它们的主序列包括这些特定残基的足够数量。 验证ELP带的分子量对应于从ELP基因，因而没有多余的杂质带都存在预期的理论分子量。注：某些电子学习产品迁移具有明显分子量比他们预期的9兆瓦，27高者可达20％。 6性质：基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱的 – 飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS） 制备ELP溶液中含有0.1％三氟乙酸来实现的约25微米的ELP浓度为50％乙腈水溶液。注意：此解决方案应该是免费的盐，所以必须ELP纯化后进行透析，H 2 O 制备饱和芥子酸中含有0.1％三氟乙酸的50％乙腈水溶液中的基质溶液。 加入1μl的ELP溶液到9微升的基质溶液，以达到约2.5皮摩尔/微升的ELP浓度。注：此混合物可与基质溶液被进一步稀释，以优化MALDI-TOF信号。 存款1-2微升ELP-矩阵混合物在金属MALDI板，让现场完全干燥。 获得5-10谱与MALDI-TOF确定质荷对ELP的比（m / z）和推断其测量兆瓦。 7。Characterization为程序升温比浊法和动态光散射确定ELP通过程序升温比浊法的T T： 备中所需的缓冲ELP溶液的稀释系列（ 例如 ，从5-100微米）。 使用温度控制的紫外可见分光光度计，测量光密度（OD）在350nm处以上以1℃/ min的升温速率的温度范围内（ 如 20-80℃）。注意：如果没有增加外径是看到了T T可能会超过仪器的温度上限。表观T T可以通过加入NaCl降低。从1开始，M氯化钠和直到ELP过渡是一个可测量的温度范围内检测到增加步长为0.5M的。 通过测量降低外径比相同的温度范围内以1℃/ min的冷却速度验证ELP过渡的可逆性。 确定同源的T T聚合物ELP通过识别浊度曲线的拐点（OD值作图温度）。注：此温度可以从OD曲线，其中对应于所述导数的最大值的温度被定义为T T的导数很容易地确定。更复杂的电子学习产品架构将显示更为复杂的浊度型材和7.2节所述，应进一步分析。 可显示更为复杂的热性能（ 例如 ，ELP二嵌段共聚物的自组装成球状胶束）电子学习产品的附加 ​​特性是通过动态光散射（DLS）来实现： 制备ELP溶液中所需的缓冲区，并通过过滤与20-450 nm的孔径合格的试样。注：过滤器孔径的选择将依赖于有无，大小，和在溶液中的任何ELP的组件的稳定性。最小的可行的过滤孔径是优选的，以消除污染物，如尘土，使尘土减少DLS测量的质量。当时，通过更小的过滤器的孔径传递一个电子学习解决方案显著性经历了一个较大的过滤孔径应该被使用。 测量的流体动力学半径（R H）以上，对应于在浊度更新确定感兴趣的区域中的温度范围内进行。注：ELP unimers通常有一个R H <10纳米，纳米粒子装配有R H〜20-100纳米，聚集有一个R H> 500纳米。在R H每次增加应该对应于在350nm处通过UV-Vis分光光度法作为温度的函数，它正比于颗粒的尺寸测量的增加OD。