Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.
Spermien sind ziemlich einzigartig unter den Zelltypen. Obwohl in den Hoden produziert werden beide Kern Gentranskription und Translation augen, wenn der Vorläufer-Knopfzelle beginnt, sich zu verlängern und differenzieren, was morphologisch als Samenzelle erkannt geschaltet. Jedoch ist das Spermium sehr unreif, da sie keine Möglichkeit für die Motilität oder Eiererkennung. Diese beiden Ereignisse auftreten, sobald die Spermien Transit eine sekundäre Organ als Nebenhoden bekannt. Während der ~ 12 Tage Passage, die es dauert, bis eine Samenzelle, durch den Nebenhoden übergeben, post-translationale Modifikationen bestehender Proteine spielen eine zentrale Rolle bei der Reifung der Zelle. Ein wesentlicher Aspekt solcher ist Proteinphosphorylierung. Um Phosphorylierung Ereignisse während Spermienreifung stattfindet zu charakterisieren, müssen sowohl reine Samenzellpopulationen und Pre-Fraktionierung von Phosphopeptiden eingerichtet werden. Mit Rückspülung Techniken, ein Verfahren zur Gewinnung von reinem Spermien of hohe Qualität und Ausbeute der distalen oder Schwanznebenhoden skizziert. Die Schritte zur Solubilisierung, Verdauung und Vorfraktionierung von Spermien Phosphopeptide durch TiO 2 Affinitätschromatographie erläutert. Nachdem sie isoliert wurde, kann Phosphopeptide in ein MS eingespritzt werden, um beide Protein Phosphorylierungsereignissen spezifischen Aminosäurereste während der Spermareifung Prozesse zu identifizieren und zu quantifizieren, die Niveaus der Phosphorylierung stattfindet.
Nachdem aus dem Hoden entstanden, sind Spermien stark dennoch bemerkenswert unterscheiden, sind diese Zellen unreife 1,2. Als solcher, fehlt ihnen die Funktionalität, einschließlich der Fähigkeit zu schwimmen und zu binden, um eine Eizelle 3. Obwohl weitere Reifung der Samenzelle erforderlich ist, kann dies nicht mittels kanonischer Routen stattfinden, da in diesem Stadium ihrer Zelldifferenzierungsprozesses, unfähig Gentranskription und ferner Proteinbiosynthese 4 sind. Biologische Kompetenz basiert auf Spermien übertragen als sie aus dem Hoden und geben Sie einen Teil der männlichen Geschlechtsorgane als Nebenhoden 5 bekannt. Der Nebenhoden ist ein eng gewickelten, hoch differenzierte Rohr, das die Ausführungsgänge (der Hoden) wird an der Samenleiter und ist in allen männlichen Säugetieren 6 vorhanden. Spermien schrittweise ihre Düngepotential während Nebenhoden Abstieg zu erwerben, die sich auf die sich ständig verändernden Umgebung, die Lumen crvon den lokalen Nebenhoden Epithelzellen 7 eated. Die verschiedenen sekretorischen und wieder aufnahme in der Nebenhoden Milieu Akt gegenwärtigen Aktivitäten der Spermien selbst zu verändern, Änderung seiner Protein-, Kohlenhydrat- und Lipidzusammensetzung 6. Die Bedeutung der Nebenhoden, insbesondere die anfängliche "caput 'Bereich dieser Struktur wurde mit chirurgischen Ligationstechniken 8 veranschaulicht. Spermien im Hoden von Ausführungsgang Ligation erhalten fehlen völlig in irgendeiner Eigenschaft, um die Eizelle zu befruchten 9-11.
Zusätzlich zu den Nebenhoden Umwelt, um Signalwege innerhalb der Spermien Arbeit posttranslational ändern Sie den vorhandenen Samenzelle ergänzen. Zum Beispiel, Spermien aus den frühen Regionen der Epididymis die unterschiedliche Muster der Protein-Phosphorylierung im Vergleich zu den letztgenannten Regionen 5,12. Dies ist nicht überraschend, da es große Unterschiede in der capability der Spermien aus diesen Regionen. Zum Beispiel Spermien aus dem frühen, caput Nebenhoden sind immotilite. Im Gegensatz dazu werden Samenzellen von der Cauda Region nach vorne durchlaufen progressive Motilität einmal in isotonischen Medium platziert. Da Nebenhoden Samenzellen nicht in der Lage de-novo Proteinbiosynthese sind, müssen alle intrinsischen Weg der Regulierung Spermienfunktion durch post-translationale Modifikationen (PTM) sein. Daher liegt es nahe, dass die Proteomik Vernunft, insbesondere die Untersuchung der PTMs wie Phosphorylierung muss eine große Schubkraft, wenn wir Spermienreifung verstehen.
Eine alternative Methode, um Spermien aus den epididymidies erhalten zu bedienen Retro-Rückspülung 13-16. Obwohl diese Technik sicherlich zeitaufwendig und nimmt einen höheren Grad der Geschicklichkeit der Bedienungsperson, erhalten die Spermatozoen Reinheit von über 99,99% zeigen durchweg. Zusätzlich, im Gegensatz zu allen anderen Techniken Spermatozoen can in einem Ruhezustand isoliert werden, wodurch es möglich zu untersuchen, wie die Beweglichkeit der Spermien wird eingeleitet. Als Probenvorbereitung ist der wichtigste Aspekt für die Proteomanalyse, Isolierung der Spermien hat sich zu einer der wichtigsten Aspekte der Spermien-Proteom-Studien. Dieses Protokoll sieht eine Erklärung wie Spermien aus dem Nebenhoden Cauda isoliert. Im Anschluss daran wird die TiO 2 Phosphopeptidanreicherung Verfahren dargelegt, mit spezieller Bezugnahme, wie Peptide, die von den hochdifferenzierten Spermien gewinnen. Die MS-Ansatz kann verwendet werden, um wechselnde Phosphopeptide zu unterscheiden wenn man die Nebenhodenschwanz Spermatozoen in einem Zustand zu vergleichen (unbeweglich oder Nicht kapazitierten) zu einem anderen (beweglich, kapazitierten, Akrosom reagierte, etc.) so dass dies ein leistungsfähiges Konzept für Spermien zu untersuchen Funktion.
Die entscheidenden Schritte für eine erfolgreiche und reproduzierbare Proteomanalyse von Spermatozoen sind: 1) die Reinheit des Ausgangsmaterials; 2) Entfernung von unerwünschten Salzen und Detergenzien; 3) Denaturieren Proteinen in vollem Umfang um zu ermöglichen, Trypsin, eine hohe Ausbeute der Proteine zu verdauen, und 4) die Probenhandhabung zu minimieren, um den Verlust von Peptid zu reduzieren.
Um die Cauda Nebenhoden erfolgreich rückmelden, ist es wichtig, den Bereich, aus dem der Spermien wird verlassen zu lokalisieren. Im Fall von Ratte und Maus, ist dies an dem Scheitel der konkaven Fläche, in der Mitte des kaudalen Bereich des Nebenhodens (siehe 2A). Wenn man weiter in Richtung auf den Vas deferens geht, ist Rückspülen erleichtert und die Erfolgsrate in der Regel höher. Allerdings geht dies zu dem Verlust der Spermienzahlen. Alternativ, wenn man versucht, auf den Korpus zu bewegen weiter proximal, dann ist die Menge an Druck erforderlich, um die Spermien durch den epididym zurückzudrängenal Kanäle oft so hoch, dass eine Beschädigung der Epididymis unweigerlich auftritt.
Rückspülen der Epididymis ist traditionell unter Verwendung von mit Wasser gesättigten Mineralöl und eine ausgeglichene Salzlösung in der Spritze selbst als ein Medium, um die Spermatozoen 22-25 entfernen. Beide Verfahren sind potenziell problematische der LC-MS. Erstens ist Mineral wahrscheinlich die Nano-C18 Nano-Säulen, die im Grunde weltweit für Proteomanalyse und Pflege verwendet werden, müssen getroffen werden, damit keiner vorne in das Verfahren durchgeführt zu blockieren. Wenn dies auftritt, ist es unmöglich, weiter, und die Probe wird im wesentlichen verloren. Dies kann durch die Verwendung von BWW oder andere ausgeglichene Salzlösungen in der Spritze jedoch überwunden werden, auch wenn dies erfolgreich ist, wir bald erkannt, dass viele der Spermatozoen sich beweglich, sobald der BWW-Lösung in Kontakt kam, und der Schwanz epididymalen vermischt Zellen. Um dieses Problem zu umgehen, haben wir rückmelden Sie einfach die Spermien mit Luft. Nicht nur ist die Qualkeit von Spermatozoen vergleichbar mit der flüssig-basierten Methoden, aber die Menge ist identisch.
Phosphoproteomik ist vielleicht eine der wenigen Möglichkeiten, um festzustellen, welche Signalwege sind an Spermien nach der Ejakulation auftreten. Einer der Hauptwege wir untersuchen ist der Prozess der Kapazitation. Spermatozoen unterziehen müssen "Kapazitation", bevor sie in der Lage zur Bindung an ein Ei ist. In der Praxis wird dies im wesentlichen durch Inkubieren Spermatozoen für einen Zeitraum erreicht (; Ratte 1,5 h; Maus 40 min menschlichen 3-24 h) in BWW-Lösung mit Serumalbumin. Zuvor haben wir und andere eine Rolle für mehrere Kinasen in Kapazitation beteiligt gezeigt. Von Interesse, Deletion des PKA μ II herzustellen Mäusen, deren Spermien schwimmen in vitro spontan, können aber nicht die Hyperaktivierung 26 zu unterziehen. Letzteres ist ein Markenzeichen der Kapazitation, wobei Spermien verändern ihre Schwimmmuster von hoher Geschwindigkeit und niedriger Amplitude, auf einen niedrigenGeschwindigkeit, schlagen hohe Amplitude Frequenz. Wir haben gezeigt, Downstream-Kinasen an diesem Prozess beteiligt sind pp60-Börsenaufsicht (SRC) 13,27 c-ja 28 und c-ABL-14. Interessanterweise Hemmung des SRC stoppt Kapazitation abhängigen Tyrosinphosphorylierung 13. Dies kann jedoch mit Okadainsäure überwunden werden, was darauf hindeutet, dass SRC wird nicht direkt in der allgemeinen Einsetzen der Tyrosinphosphorylierung 29 beteiligt ist, sondern kann eine Phosphatase 29 regulieren. Das Problem bei der Verwendung BWW als Medium, um Spermien aus dem Nebenhoden zu zwingen ist, dass einmal aktiviert, Maus Spermien erst ca. 40 min zu befähigen. Da die Isolation von Spermatozoen 5 min / Maus und oft mehrere Mäuse werden in einem Experiment verwendet, so will Spermatozoen zu verschiedenen Reifestadien zu Beginn des Experiments. Um dies zu überwinden, kann Luftdruck verwendet, um die Spermien aus den Nebenhoden Schwanz in eine Glaskanüle zu drücken. Nicht nur sind die Spermien inactive und im Wesentlichen, wie sie in der Schwanz Milieu gefunden werden, macht es möglich, unbewegliche und bewegliche Phosphoproteomik vergleichen.
Probenhandhabung für Phosphoproteomik sollten auf ein Minimum beim Vergleich von Spermien in zwei verschiedenen Funktionszuständen gehalten werden. Die Verwendung von Methanol Chloroform gegenüber anderen traditionellen Methoden der Proteinfällung 1) verringert die Notwendigkeit für zusätzliche Waschschritte, 2) entfernt fast alle Spuren von Salzen und Fetten und 3) eine nachgewiesene Fähigkeit, geringe Häufigkeit Proteine über TCA 19 auszufällen. Proteinfällung vor Trypsinverdau wird empfohlen, da wird nicht nur dazu beitragen, Protein (die Trypsin Verdauung hilft) denaturieren, aber beseitigt viele der in der Zelle vorhandenen MS-inkompatible Metaboliten.
Der Vergleich von Spermien Phosphopeptide können in einer Anzahl von Wegen durchgeführt werden. Auf der Grundebene, einen einfachen Vergleich des identifizierten Phosphopeptid in einer Probe, der in einem anderenProbe in dem Verfahren als "spektrale Zählung" bekannt sind, können durchgeführt werden. Aber Kritik an diesem Ansatz im Grunde, weil frühe Proteom-Studien wurden mit niedrigen Wiederholungen gewesen (für eine ausführlichere Diskussion siehe Lundren et al. 30). Eine anspruchsvollere Ansatz ist es, an der Intensität des Peptids Ausgangsmasse schauen und vergleichen Sie dies mit den anderen Proben (markierungsfreie Vergleich). In dem in 4 gezeigten Beispiel kann ein Peptid abwesend vom vom unbeweglichen (Figur 4 oben), sondern in der beweglichen vorhanden (Abbildung 4 unten) Spermatozoen von m / z 650-670 ersichtlich. Dieser Prozess, der als MS-Label kostenlose Quantifizierung bezeichnet eine markierungsfreie Strategie.
Eine alternative Strategie häufig verwendet, um den Betrag der Durchläufe für die Proteom-Quantifizierung zu reduzieren ist, um Isotope verwenden. Da die Masse eines Isotops anders ist, kann das Massenspektrometer verwendet, um die Intensitäten des Elut vergleichening Peptiden. Jedoch anders als die meisten anderen Zelltypen, einige Isotopenmarkierung kann nicht an Spermien aufgebracht werden. Zum Beispiel kann die Zugabe von stabilen Isotopen (eines schwereren Isotops wird zu einer Probe zugesetzt, während eine leichtere Version wird zu einer anderen zugegeben) in Gewebekultur verwendet werden. Wenn die Isotope bekommen in das Protein eingebaut, kann eine Proteomanalyse durch die Kombination der beiden Proben (Multiplexing) durchgeführt werden. Jedoch in dem Fall von Spermatozoen, kann dies nicht erfolgen, einfach aufgrund der Tatsache, daß 1) eine Isotopenmarkierung erfordert mehrere Durchgänge (bis zu 8) in der Gewebekultur und 2) die Spermien hat keine Kern-Gens die Transkription und Translation und somit sie nicht die Isotope in alle ihre Protein integrieren können trotzdem. Ein Weg, um dieses ist radioaktiv markiertem Mäuse bestellen, diese sind jedoch extrem teuer. Ein alternativer Ansatz besteht darin, eine chemische Markierung verwenden. Dies wurde gemacht, wenn nicht-kapazitierten Mäuse wurden mit kapazitierten Mäusen verglichen. In diesem Fall ist ein D 0 und ein D <sub> 3 -Marker wurde verwendet, um zwischen einer Probe und einem anderen in dem Massenspektrometer 31 zu unterscheiden. Andere Ansätze können die Verwendung von iTRAQ (iTRAQ), wobei Lysinen chemisch unterschiedlicher Masse Isotopen gehören; iCAT (Isotop codierte Affinitäts-Tag), wobei Cysteine mit unterschiedlichen Massen Isotopen und schwere und leichte Wasser Kennzeichnung versehen.
In jedem einzelnen Fall muss allerdings eine Sache, die im Auge behalten werden. Die MS nur berichtet, was in einer Probe vorhanden ist, und das ist ein Spiegelbild der alles, was in diesem Beispiel bis zu diesem Zeitpunkt geschehen ist. Minimierung der Probenhandhabung bei gleichzeitiger Maximierung der Ausbeute bei jedem Schritt ist für eine erfolgreiche Proteomanalyse notwendig.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge the NHMRC for career development award and grant support APP1066336 which supported this work.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
2,5-dihydroxy-1,4-benzoquinone | Aldrich | 195464 | |
2-D Quantitation Kit | VWR (GE Healthcare) | 80-6483-56 | |
Albumin from bovine serum | Sigma | A7030 | |
Ammonia Solution 25% | Merck | 1.05432 | |
Ammonium Bicarbonate | Sigma | A6141 | |
Calcium Chloride | Sigma | C5080 | |
CHAPS 3-[3-(cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate | Research Organics | 1300C | |
Chloroform | BDH | 10077.6B | |
di-sodium hydrogen phosphate | Merck | 1.06580 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9779 | |
Formic Acid | Sigma | O6440 | |
Glucose | Sigma | G6152 | |
Glutamine-L | Sigma | G7513 | |
Hepes (free acid) | Sigma | H3375 | |
Iodoacetic acid free acid | Sigma | I4386 | |
Lactic Acid | Sigma | L1750 | |
Magnesium Chloride | Res. Org. | 0090M | |
Methanol | Merck | 10158.6B | |
Percoll (sterile) | VWR (GE Healthcare) | GEHE17-0891-01 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail Halt | ThermoFisher Scientific (Pierce) | PIE78420 | |
Potassium Chloride | Sigma | P9333 | |
Potassium Hydrogen Carbonate | Medical Store | CH 600 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S3817 | |
Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
Sodium di-hydrogen phosphate | Merck | 1.06346 | |
Sodium hydrogen carbonate | BDH | 10247.4V | |
Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | |
Tris Ultra Pure Grade | Amresco (Astral) | AM0497 | |
Trypsin Gold-Mass Spec Grade | Promega | V5280 | |
Urea | Sigma | U5128 | |
Zinc Chloride | Sigma | Z0173 | |
0.4 mm polyethylene tubing | Goodfellow | ET317100 | |
30 gauge needle | Terumo | NN2038R | |
3 mL syringe | Terumo | SS035 | |
4.2 mm polyethylene tubing | Goodfellow | ET317640 | |
Braided silk (5-0) | Dynek | CSS0100 | |
Trichloroacetic acid | Sigma | 299537 | |
TiO2 beads (from disassembled column) | Titansphere | 6HT68003 | |
Eppendorf Tube | Eppendorf | 22431081 | |
C7B30 | Sigma | C0856 |