Характеристика многослойных рыбьей чешуи (<em> Atractosteus шпатель</em>) Использование Наноиндентирование, РКТ, Фурье-ИК и SEM

1. Рыбья чешуя Подготовка образцов Для этого исследования, весы были получены из армии США инженером научно-исследовательского центра (ERDC) Экологическая лаборатория на середине длины (29-й хвостовой колонка) от долгого около 600 мм гр (А. шпателем). В рыбья чешуя были получены в соответствии с ERDC и Национального института здоровья (NIH) руководящие принципы по уходу за животными. Материалы Запишите пространственное положение на рыбу весов, полученных для исследования. Убедитесь придерживаться соответствующей организации или государственных принципов для получения биологических образцов, таких как руководящие принципы по уходу за животными NIH. Хранить весов в адекватной среде, такой как фосфатно-буферном солевом растворе, чтобы сохранить гидратации и поддерживать содержание минеральных веществ, как только они будут удалены из рыбы. Избегайте длительного хранения, которые могут привести к потере минеральной, которые могут повлиять данные Наноиндентирование. Используйте кисть со средним ворсом и т.weezers для удаления мягких тканей с жестких масштабах. Образец Монтажные и секционирования Рассматривая поперечный разрез короткого оси рыбьей чешуи (рисунок 1), используя Фурье-ИК и наноиндентирования требуется сначала монтажа весов в жесткой среде, такой как из двух частей эпоксидной смолы, состоящей из смолы и отвердителя. Используйте общего назначения RT отверждения эпоксидных смол с низкими температурами пик таких как коммерческой эпоксидной смолы общего назначения, используемых в данном исследовании, у которого была пиковую температуру меньше 55 ° С Рисунок 1. Рентгеновская КТ образы А. шпатель масштаб изображением поперечного сечения короткой оси, рассмотренный в данном исследовании А. шпатель с помощью наноиндентирования и FTIR [A (передний), P (задний), D (спинной), V (брюшной)]. </Р> Держите чешую в 32 мм образца диаметр плесени помощью имеющегося в продаже держатель пластиковой образца. Это держит образец правильной ориентации при монтаже в эпоксидной смолой. После того, как образец проводится в форме, залить неотвержденный эпоксидную смолу на образце, а затем позволить эпоксидной вылечить в соответствии с инструкциями изготовителя. После того, как эпоксидная вылечена, раздел монтируется образец с помощью алмазный диск высокоточной отсечку видели в средней линии образца. Разрушать ультразвуком в дистиллированной воде в течение 15 мин, чтобы удалить весь мусор из образца. Полироли для Наноиндентирование и ИК-Фурье Для получения гладкой ровной поверхности для наноиндентирования, как показано на рисунке 2, следующая процедура полировки и параметры предложил на основе обсуждений с производства шлифовальной и образцов. Однако эти параметры могут должны быть скорректированы для различных биоматериалов на основе ответовтаких как съема материала. Ультразвуком образцов в ванну с дистиллированной водой между полировки шагов важно обеспечить частиц из грубых шаг полировки не вводят в последующей тонкой полировки шагом. Рисунок 2. Изображение полированной короткой оси поперечного сечения А. шпатель масштаб установлен в эпоксидной смолой. Грубый для ногтей с подушкой 15 мкм SiC и воды в качестве смазки, пока образец не является плоской с помощью автоматического полирующей головки силу 7 фунт-сила и скорости 200 оборотов в минуту (RPM). Обрабатывают ультразвуком образца в ванну с дистиллированной водой в течение 15 мин. Промежуточный ногтей с подушкой 6 мкм SiC с использованием воды смазку при скорости валика 130 оборотах в минуту и ​​сила 7 фунт-сила на5 мин. Разрушать ультразвуком образец в ванну с дистиллированной водой в течение 15 мин. Польский с 1 мкм SiC площадки с использованием воды смазку со скоростью валика 130 оборотов в минуту и ​​силу 7 фунт-сила в течение 5 мин. Обрабатывают ультразвуком образца в ванну с дистиллированной водой в течение 15 мин. Итоговый польский с нм коллоидной суспензии диоксида кремния 50 с использованием соответствующего полировальник например, высокой плотности, нетканого, низким ворсом пористого полиуретана, что производитель предлагает в течение 50 нм суспензий. Польский со скоростью 130 оборотов в минуту с усилием 7 фунт-сила в течение 5 мин. Обрабатывают ультразвуком образца в ванну с дистиллированной водой в течение 15 мин. 2. Наноиндентирование Тестирование Калибровка системы наноиндентирования перед каждой серией испытаний на производит руководящие принципы. Калибровка должна включать в себя определение функции в зону действия системы для кончика Беркович и рамы жесткости. Кроме того, выполнить калибровку микроскоп-на-индентора на этом этапечтобы гарантировать, что отступы коррелируют с выбранными местах микроскопа. Загрузите образец в наноиндентор и использовать элементы управления оптического микроскопа на наноиндентор принести образец в центре внимания. С помощью элементов управления программного обеспечения для перемещения образца в месте для первого абзаца. В идеале это составляет примерно 10 мкм в эпоксидной смолы с краю ganoine слое вдоль центральной линии поперечного сечения в масштабе. Выполните 4 параллельных ряда зубцов расстоянии 15 мкм друг от друга, чтобы получить статистически значимые данные установить, начиная с этого места. Установите наноиндентор до максимальной нагрузке 5 мН, погрузки и разгрузки темпов 0,1 мН / сек, время удержания 30 сек, а минимальное расстояние отступа 5 мкм для каждой строки. Ряд зубцов должен быть настроен для запуска ортогональный к поверхности ganoine, и достаточное число зубцов должны быть указаны путешествовать по поперечному сечению шкале, в то время прохождения примерно 10 мкм в EPoXу мимо костлявой слоя. Когда партия завершена, есть наноиндентор создать фидуциальных отступы с максимальной нагрузкой 100 млн в первом и последнем абзаце, который должен быть в эпоксидной перед ganoine слоя и после костного слоя, соответственно. Они соотносятся с начальной и конечной точек для каждой строки отступов. После наноиндентировании, поместите образец обратно в растворе PBS, чтобы избежать дальнейшего обезвоживания. С помощью программного обеспечения наноиндентирования определить модуль и твердости, основанный на методе Оливер-Pharr 13, если наблюдается материал зависит от времени отклика. В противном случае удержания времени, возможно, придется быть продлен преодолеть сползание наблюдается от разгрузки слишком быстро. 3. Пространственным разрешением ATR-ИК спектроскопия Использование слайд-на ATR аксессуар прилагается к микроскопом ИК-Фурье является одним предложил метод сбора с пространственным разрешением преобразование Фурье инфракрасного (FTIR) спектры Лос-АнджелесеYers в рыбьей чешуи образца. ATR аксессуар позволяет для сбора спектров высокого качества с очень малой (~ 10 мкм) 2 пространственным разрешением, которое не достижимо с любой другой метод FTIR. То же самое полированный образец (рис. 2), полученного на наноиндентирования экспериментов был использован в этих экспериментах. Выбор образца с поверхности и размеров, подходящей для микроскопом FTIR используемого для анализа, чтобы обеспечить высокое качество спектры получают из ATR-FTIR spectromicroscopy. Подготовьте микроскоп FTIR для сбора данных. ИК микроспектроскопия требует калибровки сигнала FTIR при тех же условиях отбора проб как будет использоваться для измерения образца. Как правило, это включает охлаждение детектора и позволяет времени для того, чтобы стабилизировать а также сбора весь фоновый спектров и спектров образца при тех же условиях окружающей среды. Это может быть особенно важно, потому что пара СО 2 и воды в воздухе может гramatically повлиять ИК спектры. Важно также, чтобы убедиться, что оптика прибора, выровнены. Сбор соответствующий спектр фона вычесть образец против. Для этих экспериментов, полированный, с золотым покрытием стекло микроскопа был использован в качестве фона для ИК-Фурье spectromicroscopy. С помощью соответствующего цели, сосредоточиться на образце и выберите область интереса для анализа. После того, как сфера интересов находится прикрепите аксессуар ATR для объектива микроскопа ИК-Фурье, поднять образец, пока он не входит в тесный контакт с внутренним элементом отражения ATR, и собрать спектр образца. После сбора спектры FTIR, выполните требуется необходимым стандартным обработки данных. 4. Рентгеновская компьютерная томография (КТ) Получить и подготовить шкалу, как описано в разделе 1.1 Установка сканера Разминка источник рентгеновского излучения в соответствии со спецификациями завода-изготовителя. Набор рентгеновская напряжение и ток до 50 кВ и 160 мкА, соответственно. Установите время экспозиции, чтобы 1450 мс. Выберите 1,0 мм алюминиевый фильтр. До загрузки образца, сделать поправку плоским поля при рентгеновский источник выключен (в темном поле) и на (ярко-поле). Mount и нагрузки образца Весы должны быть установлены таким образом, чтобы они не смещаются или перемещать по всей длине сканирования. Эти образцы также должны быть установлены с использованием материалов, которые практически прозрачны для рентгеновских лучей. Сочетание пенопласта и парафильмом могут быть использованы, чтобы обеспечить шкалу на стадии CT. Жестко закреплен образец таким образом, чтобы наибольший размер параллелен детектора. Закрепите установленный образец на сцену сканера. Поместите образец так, что она будет в центре вращения по всей проверки. Выберите самое высокое разрешение, что позволяет весь масштаб, чтобы быть в поле зрения (FOV), в данном случае7,5 мкм. Настройки Приобретение Выполнять сканирование в этом исследовании с вращательным шаге 0,25 ° и значением кадр усреднения 15. При более низких разрешениях являются приемлемыми, увеличить размер шага и / или уменьшить кадр в среднем сократить общее время сканирования. Параметры реконструкции После того, как набор данных получен, восстановить проекционные рентгеновские изображения, чтобы создать набор данных, содержащий изображения поперечного сечения. Выберите настройки по умолчанию NRecon программных SkyScan в за исключением следующего. Измените Изменить Кольцо Артефакт до 20. Измените Изменить Луч Hardening до 25%. Отрегулируйте CS Static Rotation сделать поперечного сечения уровень изображения. Обработка изображений Использование программного обеспечения SkyScan в CTAN для получения конечного 3D, черно-белое изображение. Настройте диапазон серой шкалы на соответствующем уровне, чтобы удалить артефакты из пенополистирола и парафильмом. <p class= "Jove_title"> 5. СЭМ изображений и анализ EDX Образцы, подготовленные полировки для наноиндентирования и micro-/nano-structure характеристики были изучены с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM). Режим низкого вакуума была использована, чтобы минимизировать обезвоживание образцов и необходимость применения проводящих покрытий. Часовой химический анализ проводили на полированных образцов в сочетании с SEM визуализации с использованием энергии-дисперсионные рентгеновской спектроскопии (EDX). EDX анализ проводили на той же линии / сетки, анализировали с помощью наноиндентирования для обеспечения корреляции между химическими и механическими свойствами. Недавно перелом поверхности были также рассмотрены SEM для обеспечения более полной информации о морфологии и ориентации biomineralized структур, присутствующих в рыбьей чешуи. Чтобы улучшить качество изображения для наблюдения за нано-структуры на поверхности излома, образцы напылением золота (Au) и отображается в режиме высокого вакуума. Следующийпредоставляет дополнительную информацию о процедурах, применяемых. SEM Визуализация полированных поверхностей Наведите полированного образца в SEM камеры и насос камеру в режим пониженного вакуума с камеры давления от 0,1 до 0,5 мбар. Отрегулируйте рабочее расстояние примерно 5,0 мм. Активируйте высокого напряжения (HV) и перейдите к интересующей области на образце, который включает переходную зону между ganoine и костных подслоях или других областях, представляющих интерес. Получение изображений в HV 15 кВ и током пучка около 3,9 нА. Фокус изображение и выполнять все необходимые выравнивания и корректировки stigmation. Захват изображения с не менее трех регионах, представляющих интерес на соответствующих увеличениях (обычно 250X до 10000 X) с помощью низкого вакуума обратного рассеяния электрон (БФБ) детектора, чтобы помочь в идентификации изменений в биоминеральной содержания и плотности (то есть, плотные кости против пористые кости ). SEM Визуализация поверхности излома Прикрепите недавно перелом образца к заглушке 90 ° SEM помощью двусторонней углерода ленту с поверхности разрушения вверх. Sputter слой с Au с получением густого проводящий слой суб-нм на поверхности излома. Поместите образец в SEM камеры и насос камеру в режим высокого вакуума. Отрегулируйте рабочее расстояние до от 3,0 до 5,0 мм. Активируйте HV и перейдите к регионах, представляющих интерес на образец. Основные области, представляющие интерес в этом случае были структура присутствует в ganoine и костных слоев. Получение изображений в пределах от 5 кВ и 15 HV кВ и более низкой током пучка 0,24 нА чтобы улучшить качество изображения. Первоначально сосредоточиться образец и выполнять предварительные выравнивания. Увеличение увеличение до более чем 5000 X и переход от нормального объектива эмиссии поля в погружной / сверхвысоким разрешением (UHR) линзы. Выполните UHR выравнивания и корректировки stigmation. Захват изображения с не менее трех регионах Oе интерес у соответствующих увеличениях (обычно 5000 X до 250000 X) с помощью через детектор объектива (TLD), работающие в вторичных электронов режиме (SE). EDX анализ полированных поверхностей (выполняется совместно с изображениями SEM). Эти параметры материала зависит и должны быть скорректированы таким образом, объем взаимодействия EDX похожа по размеру с объемом наноиндентирование взаимодействия как обсуждалось Мозером 14. Перейдите к области интереса на полированного образца, которая включает наноиндентирования сетку, указанный точек отсчета в конце каждой строки отступов. Убедитесь, HV составляет не менее 15 кВ, ток пучка составляет не менее 3,9 нА, а рабочее расстояние больше, чем 5,0 мм. Захват BSE образ региона, которые будут проанализированы с помощью EDX. Использование ПО EDX анализа, захватить и то же изображение, чтобы помочь в поиске областей провести химический анализ по линии отступов. Использование «Анализ линия" технику, POsition линию для выполнения химического анализа по линии интересах отступов, начиная с первого абзаца и заканчивающийся в последнем абзаце. Укажите количество точек анализа, который будет помещен вдоль линии. Лучше всего использовать такое же количество пунктов анализа и углублений, которые присутствуют для обеспечения прямого пространственную корреляцию между химическим составом и механическими свойствами. Когда линия находится и указано точки правильно, инициировать анализ строки с помощью программного обеспечения EDX. Когда анализ линия завершена, идентифицировать элементы, представляющие интерес для быть количественно из спектров, полученных точке вдоль указанной линии на полированной поверхности образца. После того, как элементы, представляющие интерес определены, выполнить калибровку фона для учета тормозного излучения и других эффектов. Выберите опцию анализа деконволюция программного обеспечения, которые, чтобы получить количественный анализ на каждой точке вдоль указанной линии к Quanтифы химический состав в каждой точке. Сохранение результатов количественного химического анализа наряду с изображением заданной линии, что было проанализировано, чтобы помочь в пространственной корреляции с механическими свойствами, измеренных с помощью наноиндентирования.