파지 - 표시 합성 항체 라이브러리의 확장 성 높은 처리량 선택
Summary
방법은 항원 동시에 수백 대해 파지 디스플레이 조합 항체 라이브러리의 합성 확장, 고 스루풋 선택을 수행하기위한 시각적 반주하여 설명한다. 이 병렬 접근 방식을 사용하여, 우리는 표준 면역의 기능적인 다양한 항원에 대한 높은 친화력과 특이성을 나타내는 항체 단편을 격리했다.
Abstract
모두 기초 연구 및 임상 응용의 요구를 충족하는 항체에 대한 수요가 높고, 향후 대폭 증가 할 것이다. 그러나, 기존의 단일 클론 기술이 작업까지 혼자가 아니라는 것을 알 수있다. 이것은 프로테옴의 모든 요소들에 접근 고품질 재생 친 화성 시약에 대한 수요를 충족시키기 위해 대안적인 방법의 개발을 유도 하였다. 이를 위해, 파지 표시 합성 항체 라이브러리에서 선택을 수행하기위한 높은 처리량 방법은 다양한 항원을 포함하는 애플리케이션을 위해 고안되었으며, 빠른 처리 속도 및 성공에 최적화. 여기서, 프로토콜은 비디오 시연 수동 96 채널 액체 핸들러 또는 로봇 자동화 된 시스템을 사용하여 타겟의 수백에 대해 높은 다이버 시티의 Fab 라이브러리로부터 파지 클론의 선택을 도시 평행 상세하게 설명한다. 이 프로토콜을 이용하여, 사용자는 하나의 항원을 생성 할 수있는 수백,병렬로 항체를 선택 6-8 주 이내에 항체 결합을 확인합니다. 강조는 다음과 같습니다 ⅰ) 가능한 항원 형식, ⅱ) 사전 선택 항원의 특성, ⅲ) 중요한 특정 및 선호도가 높은 클론의 선택에 영향을 미치는 단계, 및 ⅳ) 모니터링 선택 효과와 초기 항체 클론 특성화 방법. 이 방식으로, 우리는 단일 막 통과 수용체, 단백질 분비 호르몬, 멀티 도메인, 세포 내 단백질을 포함하는 많은 타겟 클래스 합성 항체 단편 (Fab를)를 얻었다. 이 조각은 쉽게 전체 길이 항체로 변환하고 높은 친화력과 특이성을 나타내는 것으로 확인되었다. 또한, 그들은 웨스턴 블로 팅, ELISA, 세포 면역, 면역 및 관련 분석을 포함하여 표준 면역의 다양한 기능으로 입증되었다. 이 방법은 항체 발견을 촉진하고 궁극적으로 목표 O를 실현 가까이 우리를 가져올 것이다F 프로테옴에 재생 고품질 항체를 생성하는 단계를 포함한다.
Introduction
포스트 게놈 시대의 시작과 함께, 특징 및 단백질을 조절하는 고품질의 결합 시약의 가용성은 새로운 연구 및 치료 길을 열 필수적이다. 항체는 기초 연구 및 진단 도구 및 잠재적 치료제로 모두 학문과 산업 연구원에 중요한 계속. 당연히, 사용자 정의 항체를 생성하기 위해 기존의 하이 브리 도마 기술에 의존하는 대부분의 계약 항체 개발 기업의 인상적인 성장이 있었다. 그럼에도 불구하고, 파지 디스플레이 항체 라이브러리를 사용하여 체외 선택은 기존의 기술 한계 1, 2에 직면 수있는 고유의 장점과 성공을 제공 할 수있는 강력한 대안 기술이되고있다.
연구 도구, 생성하는 두 가지 주요 과제로 높은 품질의 항체에 대한 상당한 수요에 비추어 신 재생 항체는 1) 선택 처리량과 2) 항원 유명하다ailability. 그룹 번호는 현재 처리량 및 항체 인식의 속도를 향상 목적 체외 선택 파이프 라인에서 설명 하였다. 이러한 설명 세부 전체 길이 중 하나에 선택 등이 가능한 다양한 접근 방식을 사용, 2, 3, 4 대상으로, 또는 구조적 도메인 5,6,7 관련 중 하나 비드 기반 6,8 또는 3,4 항원 고정화 방식을 기반 접시입니다. 또한, 유전자 합성 기술 (9)의 성장 채택 합리적 비용 효과적인 잠재적 정제, 전장 항원의 충분한 양을 얻는 데 어려움을 완화 할 수 특히 고립 도메인으로 체계적인 항원 생성을 만들었다. 나란히 두 기술을 사용함으로써, 자 급식 및 확장 항원 생성 및 항체 선택 파이프 라인 표현 항원 도메인 큰 세트 항체 평행 절연을 가능하게하고 차 시약의 개발을 촉진 것이라고 고안했다구조적으로 또는 기능적으로 관련 단백질의 전체 클래스를 racterizing.
이 목표, 표현할 수있는 항원 도메인, 유전자 합성, 항원과 확장 성을 파지 디스플레이 항체 선택의 높은 처리량 세균 표현의 실리 식별의 부부가 개발 한 통합 파이프 라인을 향해. 이 파이프 라인은 (라이센스 또는 물질 전달 계약을 통해 점점 사용할 수있는 항체 라이브러리 포함) 대부분의 생명 과학 실험실에서 사용할 기본적인 인프라가 필요합니다,뿐만 아니라 산업적인 규모에서 사용하기 위해를 자동화에서 쉽게 다룰 수있다. 이 프로토콜을 이용하면, 친 화성 태그 항원 수백 도메인을 생성 할 수 있고, 통상적으로 이들 중 많은 항원에 매우 특이 적 항체 단편을 분리.
파지 디스플레이 기술 된 Fab, scFv를, 자율 된 Fv 도메인과 재조합 포함한 친 화성 시약 다양한 포맷과의 호환성을 입증했다 도시작은 '대안 프레임 워크'(설계 ankyrin 반복 단백질 (DARPINS), 피브로넥틴 (FN), 리포 칼린 도메인과 10 개)의 성장 배열입니다. 그것은 이러한 방법은 다른 유형의 라이브러리에 적용 할 수있는 것으로 추정되지만 토론은 항체의 Fab 단편의 단리 본 예에서는 제한된다. 이 기술을 사용하면, 작은 낮은 나노 몰 친화 팹, 전장 단백질 결합과 같은 면역과 같은 면역 기능적 이는 많은 RNA 결합 단백질 등이 성공적으로 선정 된 전사 인자 도메인, SH2 도메인을 포함한 단백질 도메인 듣기 , 면역 및 면역 조직 화학. 중요한 것은, 재조합 바인딩 클론이 완전히 재생하고 표현에서 다시 생성 될 수있다, 따라서 엄격한 복제 검증의 비용을 정당화, 박테리아 생산 제공 일관성 향상, 재현성 및 비용 효율성을 통해 구성한다.
이 제자에ocol 및 첨부 동영상은, 고정 된 항원 도메인을 사용 파지 디스플레이 라이브러리의 항체 선택을위한 기본적인 방법은 입증된다. 다른 태그 11,12,13 및 선택 포맷이 성공적으로 사용되어왔다 13,14,2 있지만이 특정 방법은 마이크로 웰 플레이트에서 수동 흡착에 의해 고정 된 GST-태그 단백질 도메인을 사용합니다. 식별 및 검증을 위해 특별히 풍부한 클론 항체를 분리하기위한 선택 매개 변수의 병렬 모니터링 선택의 설정 및 행동에 중요한 고려 사항이 자세히 설명되어 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
시험 관내 항체 선택에서 수행 할 때, 선택 성공의 두 가지 주요 결정 요인에 따라 선택하는 선택) 잘 접혀진 표적 항원의 분리 (1)이며, 2) 높은 다이버 시티 기능성 항체 라이브러리의 이용. 많은 경우에, 잘 접혀, 전체 길이 단백질의 충분한 양의 가용성은 제한 될 수있다. 이러한 제한을 극복하는 한 가지 방법은 적당한 친 화성 태그 박테리아 발현 벡터에 삽입 생물 정보 학적 분석 <…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 NIH 일반 기금을 감사드립니다 – 단백질 캡처 시약 프로그램 재조합 항체 네트워크 항체 선택 및 특성화 파이프 라인 및 로봇 선택 플랫폼의 자금 조달 구매 혁신에 대한 캐나다 재단의 개발 자금을 지원합니다.
Materials
| MATERIALS | |||
| Name | Company | Catalog Number | |
| New Brunswick Innova44 stackable incubator shaker | Eppendorf | M1282-0004 | |
| Liquidator 96 channel manual benchtop pipetting system | Anachem Ltd | LIQ-96-200 | |
| Microplate shaker | VWR | 12620-926 | |
| ThermoScientific Sorvall ST-40 benchtop centrifuge | Thermo Product | 75004525 | |
| ELx405 Select Deep Well Microplate Washer | Biotek | ELX405USD | |
| Custom High Throughput Automated Phage Selection Robot | S&P Robotics | ||
| Plastic conical Falcon tube: 50 mL | VWR | 21008-178 | |
| Plastic conical Falcon tube: 15 mL | VWR | 89039-668 | |
| Axygen 1.7 mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-175-L-C | |
| 96-well/384-well Maxisorp plate | Sigma | M9410-1CS | |
| Corning 96-well V-bottom deep-well block | Corning | 3960 | |
| Axygen Mini-tube 96-well sterile microplate blue box | Corning | AXY-MTS-06-C-R-S | |
| Breathable adhesive plate sealing film | VWR | 60941-084 | |
| REAGENTS | |||
| Name | Company | Catalog Number | |
| polyethylene glycol | Bioshop | PEG800.1 | |
| yeast extract | Bioshop | YEX401.1 | |
| bio-tryptone | Bioshop | TRP402.1 | |
| N-Z amine | Sigma | C7290 | |
| glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| lactose | Bioshop | LAC234 | |
| glycerol | Bioshop | GLY001.500 | |
| carbenicillin | Bioshop | CAR544.10 | |
| kanamycin | Bioshop | KAN201.25 | |
| tetracycline | Bioshop | TET701.25 | |
| Tween 20 | Bioshop | TWN510.500 | |
| monobasic potassium phophate | Bioshop | PPM302.1 | |
| dibasic sodium phosphate | Anachemia | 84486-440 | |
| sodium chloride | Bioshop | SOD001.10 | |
| potassium chloride | Bioshop | POC308.1 | |
| calcium chloride | Bioshop | CCL302.500 | |
| magnesium sulphate | EMD | MX0070-1 | |
| magnesium chloride | Bioshop | MAG510.500 | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-1KG | |
| Na2SO4 | Bioshop | SOS513.500 | |
| agar | Bioshop | AGR001.500 | |
| SybrSafe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| phosphoric acid | Acros Organics | 201140010 | |
| lysozyme | Bioshop | LYS702.25 | |
| benzonase | Novagen | 71205 | |
| Triton X-100 | Bioshop | TRX506.500 | |
| protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
| Ni-NTA resin | Qiagen | 1018240 | |
| 1000x helper phage (M13K07) stock (1013 phage per mL) | NEB | N0315S | |
| HRP conjugated M13-specific antibody (anti-M13-HRP). | GE Healthcare | 27-9241-01 | |
| TMB substrate: mix equal volumes of TMB and H2O2 peroxidase substrate | KPL | 50-76-00 | |
| dNTPs | Biobasic | DD0056 | |
| Taq polymerase | Genscript | E00007 | |
| Exonuclease | GE Healthcare | EZ0073X-EZ | |
| Shrimp alkaline phosphatase | GE Healthcare | E70092Z-EZ | |
References
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