Горячая биологического катализа: изотермический титрования калориметрия для характеристики ферментативных реакций

Количественное определение биохимических реакций дает представление о биологических процессах на основе жизни. Калориметрия предлагает методологию без наклеек, чтобы количественно охарактеризовать практически все химические реакции в растворе. Этот метод измеряет тепло, выделяющееся или поглощаются с течением времени, и, следовательно, универсальная система обнаружения и очень удобным методика для определения количества реагирующих молекул (например, связывающие термодинамики), а также для измерения скорости реакции (т.е. кинетику). В частности, изотермический титрования калориметрии (МТЦ) был принят в качестве метода выбора для характеристики термодинамики биомолекулярных равновесий с участием белка-лиганда, белок-белковых, ионы белково-металлические и взаимодействия белок-ДНК ^1-6. Кроме того, способность ЦМТ обеспечить кинетическую информации делает его очень мощная система для измерения ферментативного катализа, хотя потенциал этого приложения является ещенедооценивать ^7-9.

Уравнение Михаэлиса-Ментен ¹⁰ является количественное описание ферментативных реакций, так как она обеспечивает связь между скоростью реакции и концентрации субстрата, в зависимости от двух кинетических параметров: постоянных Михаэлис (К _М) и постоянных каталитического ставка (к _кот) . К _кот / отношение К _М называется в качестве каталитического эффективности фермента. На практике определение K _M и к _кот для специфической реакции обеспечивает полное описание катализа.

В типичной ферментативной реакции (рис. 1), субстратом (S) взаимодействует с ферментом (Е), образующего фермент-субстрат (ES) комплекс, который впоследствии активированного в переходном состоянии (ES *). Последний превращают в продукт с ферментом (EP) комплекса, который в конечном счете диссоциирует. Это шагс описываются следующей реакции.

(1)

где к ₁ является константа скорости образования комплекса ES, K _-1 является константа скорости диссоциации комплекса ES, в то время как к _кот каталитическая константа скорости или число оборотов.

В соответствии с уравнением Михаэлиса-Ментен ^10, скорость реакции может быть вычислена как:

(2)

в котором K _M = (K _-1 + к _кат) / K ₁ и K _кошка = V _макс / [С], с V _макс будучи максимальная скорость достигнута, когда все фермент связан с подложкой.

Изотермический калориметр титрования является прибор, используемый в этом исследовании, чтобы характеризовать ферментативный гидролиз мочевины. Этот инструмент сделан из адиабатического щита, содержащего два придуман формы клеток (рис. 1). Они соединены с внешней стороны узких трубках доступа. Образец клеток (приблизительно 1,4 мл) загружают раствора фермента, в то время как ссылка ячейки обычно заполнены водой или с растворителя, используемого для анализа. Вращающийся шприц с длинной иглой и с перемешиванием мешалкой прилагается, обычно содержащие ок. 0,3 мл раствора субстрата, установлен на ячейку для образца. Термоэлектрического устройства измеряет разницу температуры между образцом и опорной ячейки и, используя "сети обратной связи клеток", он поддерживает эту разницу в нуле путем сложения или вычитания тепло. В ходе эксперимента, подложка вводят в ферментном растворе при постоянной выбранной температуре. Когда анzymatic реакция происходит, количество тепла, выделяющегося или поглощается пропорциональна числу молекул подложки, которые преобразуются в молекулы продукта. Кроме того, скорость теплового потока напрямую связана со скоростью реакции. Измеренные данные, появляясь как отклонение теплового следа от первоначального базового уровня (рис. 1), представляют собой тепловую мощность (μcal / сек) поставляется векселю в кюветы, которая пропорциональна теплового потока, происходящего в кюветы с течением времени.

Рисунок 1. Схематическое представление изотермического титрования калориметра для изучения ферментативных реакций. Ферментативную реакцию происходит при титровании подложки (в шприц для инъекций) в ферментного раствора (в ячейку для образца) приводит к изменению термомал мощность, выделяемая калориметр, необходимой для поддержания разности температур между кюветы и постоянной ссылки на ячейку. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

В целом, изменение тепла (Q) пропорциональна молярной энтальпии реакции (H) и числом молей продукта, генерируемого (п), который в свою очередь задается общего кратного объема концентрации:

(3)

Формирование продукт с течением времени (DP / дт), что соответствует скорости реакции, таким образом, может быть связана с количеством тепла, сгенерированного в течение того же времени (DQ / DT) через соотношением:

(4)

Согласно этому уравнению, для того, чтобы получить Михаэлиса-Ментен участок надо измерить I) общее молярное энтальпии ΔH, и б) тепловой поток DQ / дт при различных концентрациях субстрата. Как правило, это выполняется в двух различных экспериментах: в первом эксперименте (метод 1, M1), подложка вводят в ферментного раствора и теплота для полной конверсии субстрата измеряется; во втором эксперименте (метод 2, М2), неоднократно получавших инъекции подложки выполняются и скорость образования тепла измеряется в разных концентрациях субстрата. Эти два набора данных достаточно, чтобы получить кинетические параметры К _М и к _{кошачьи.}

В настоящей статье, общий протокол для определения кинетических параметров для ферментативных реакций, выполняемых с помощью ITC описывается. Мы применили этот метод для гидролиза мочевины на Canavalia ensiformis мочевинысебе, как система отсчета. Хорошее согласие между результатами, полученными с помощью этого метода и данных, представленных в литературе свидетельствует о надежности такого подхода.