Uma imersão Ensaio: Um protocolo para avaliar Interações entre CNS fagócitos e Neurônios
Summary
Microglia são as células do sistema imunológico residentes do sistema nervoso central (SNC), com uma elevada capacidade de fagocitar ou engolir o material no seu ambiente extracelular. Aqui, um ensaio amplamente aplicável, confiável e altamente quantitativa para visualizar e medir engulfment mediada por microglia de componentes sinápticas é descrito.
Abstract
A fagocitose é um processo em que uma célula engole o material (célula inteira, as peças de uma célula, de detritos, etc) no seu ambiente extracelular circundante e subsequentemente digere este material, normalmente, através da degradação lisossomal. Microglia são as células do sistema imunológico residentes do sistema nervoso central (SNC), cuja função fagocítica tenha sido descrito em uma ampla gama de condições de doença neurodegenerativa (por exemplo, depuração da beta-amilóide na doença de Alzheimer), para o desenvolvimento do cérebro saudável (por exemplo, sináptica poda) 1-6. O protocolo a seguir é um ensaio engulfment desenvolvido para visualizar e quantificar engulfment mediada por microglia de entradas pré-sinápticos no sistema retinogeniculate rato em desenvolvimento 7. Embora este ensaio foi utilizado para avaliar a função da microglia, neste contexto, em particular, uma abordagem similar pode ser utilizado para avaliar outros fagócitos em todo o cérebro (por exemplo, astrócitos) e o resto do corpo(por exemplo, macrófagos periférica), bem como outros contextos em que a remodelação ocorre sináptica (por exemplo, lesão cerebral / doença).
Introduction
Circuitos sinápticos remodelar ao longo da vida de um animal. No cérebro em desenvolvimento, formam sinapses em excesso e devem ser submetidos a poda sináptica, que envolve a remoção seletiva de um subconjunto de sinapses e para a manutenção e fortalecimento das sinapses que permanecem 8-10. Este processo é necessário para conseguir a característica de conectividade precisa do sistema nervoso adulto. No adulto, as sinapses também pode ser de plástico, em particular no contexto da aprendizagem e da memória. As correlações estruturais desta plasticidade são pensados para incluir a adição e / ou eliminação das espinhas dendriticas e boutons pré-sinápticos 11-13. Em adição a estes papéis no sistema nervoso saudável, remodelação sináptica também está envolvido em doenças do sistema nervoso 12,14,15 / lesão. Por exemplo, após a lesão medular, os axônios cortados posteriormente deve remodelar e formar novas sinapses para alcançar funcional 16-19 recuperação.
nt "> Emergindo como um aspecto importante da plasticidade sináptica é o processo de fagocitose ou imersão das sinapses destinados à remoção 3,5,20. Recentemente, mostrou esse fenômeno no contexto de poda sináptica no saudável, pós-natal do rato do cérebro 7. Especificamente , microglia, os residentes do SNC células do sistema imunológico e fagócitos, foram mostrados para engolir entradas pré-sinápticas durante um período de pico e em uma região de poda sináptica de desenvolvimento, o pós-natal geniculado lateral dorsal núcleo (dLGN) do tálamo. bloqueio genética ou farmacológica deste engulfment resultou em déficits contínuos na conectividade sináptica.Neste protocolo, descrevemos um ensaio confiável e altamente quantitativa para medir engulfment mediada por fagócitos de entradas pré-sinápticas. Para os fins deste artigo, este ensaio será apresentado no contexto do sistema de desenvolvimento de retinogeniculate, que inclui as células ganglionares da retina (CGRs) residente na retina queprojectar entradas pré-sinápticas ao dLGN (Figura 1A). Para começar, uma estratégia de marcação anterógrada degradação resistentes lisossomal irá ser descrito, o qual é usado para visualizar as entradas pré-sinápticos específicos RGC-no dLGN (Figura 1) 7,21. Depois desta descrição, uma metodologia detalhada para imagem e medir quantitativamente engulfment usando microscopia confocal combinado com 3 dimensões (3D) superfície de processamento de volume será dado. Esta metodologia baseia-se na preparação de tecido fixo, mas pode também ser adaptado para uso em estudos de imagem ao vivo. É importante, quando o ensaio foi validado no contexto do, sistema de pós-natal retinogeniculate saudável, pode-se aplicar as mesmas técnicas para avaliar outras interacções fagócitos para neurónios em todo o cérebro e durante a doença, assim como a função de fagócitos em outros sistemas orgânicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
A fim de medir com precisão a fagocitose, material engolido devem ser rotulados de tal forma que o pesquisador possa visualizá-lo uma vez degradação lisossomal ocorreu. Além disso, a elevada resolução de imagem é necessário, seguindo-se a utilização de software que permita o investigador para visualizar o volume de toda a célula e quantificar o seu conteúdo. Neste protocolo, descrevemos um método altamente confiável e quantitativo para medir engulfment mediada por fagócitos usando CTB conjugado com tintu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho foi suportado por concessões do Smith Family Foundation (BS), Dana Foundation (BS), John Merck Scholars Program (BS), NINDS (SR1-NS-07100801; BS), NRSA (F32-NS-066698; SAD), Nancy Lurie Fundação Marcas (SAD), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC imagem Core).
Materials
| Heat pad | Vet Equip, Inc. | 965500 | |
| Warm water source for heat pad | Kent Scientific | TP-700 | |
| Stereo microscope | DSC Optical | Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope | |
| Sliding microtome with freezing stage | Leica | SM2010 R | |
| Microtome blade | Leica | 14021607100 | |
| Fluorescent dissecting microscope | Nikon | SMZ800 with Epi-fluorescence attachment | |
| Spinning disk confocal microscope | Perkin Elmer | UltraView Vox Spinning Disk Confocal | |
| 10 µl Hamilton gas tight syringes | Hamilton | 80030 | Use a different syringe for each color dye/tracer |
| Hamilton needles | Hamilton | 7803-05, specifications: blunt, 1.5" | |
| Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB) | Invitrogen | 488: C22841 | Reconstitute in sterile saline, 80 µl (488), 100 µl (594), 20 µl (647) |
| 594: C22842 | |||
| 647: C34778 | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P4417-50TAB | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment) | Bausch & Lomb | 24208-780-55 | |
| 30.5 gauge needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5630 | |
| Cotton-tipped applicator | Fisher | 23-400-125 | |
| Paraformaldeyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute 16%to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use in a fume hood and wear personal protective equipment. |
| Dissection tools – scissors, forceps, spatula | Small scissors: Fine Science Tools | Small scissors:14370-22 | |
| Large scissors: Roboz | Large scissors: RS-6820 | ||
| #55 forceps: Fine Science Tools | #55 forceps: 11255-20 | ||
| Spatula: Ted Pella, Inc. | Spatula: 13504 | ||
| Sucrose | Sigma | S8501-5KG | Make 30% sucrose in PBS (weight/vol) |
| OCT Compound | VWR | 25608-930 | |
| Weigh boat | USA Scientific | 2347-1426 | |
| 24-well plates | BD Biosciences | 353047 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S6566-500G | Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH20 and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH20. To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH20 |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136-500G | |
| Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5 | VWR | 48393 194 | |
| Charged microscope slide | VWR | 48311-703 | |
| Vectasheild | Vector Laboratories | H-1200 |
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