Cryo-microscopie électronique à la préparation des échantillons au moyen d'un faisceau d'ions focalisés

REMARQUE: tous les paramètres donnés dans ce protocole sont valables pour les instruments et les modèles indiqués ici. Certains de ces paramètres (marqués par * dans le texte) peuvent différer si un autre fabricant ou le modèle utilisé. 1. Démarrage de la FIB / SEM Montez le nanomanipulateur froid sur mesure (NM) pointe sans y attacher les tresses Cu à la anticontaminator (AC). Au lieu de s'assurer que les tresses sont reliés au reste de la NM-dessus du point d'empêcher la charge pendant l'étape d'affûtage (1.2) d'isolation. Fermer la chambre SEM, pompe à vide poussé et de l'image de la pointe de NM. Si la pointe est émoussée, tordue ou contaminés par l'utilisation précédente, l'aiguiser au moyen du faisceau d'ions: sélectionner les motifs de fraisage polygonales sur les côtés de la pointe, de sorte que, après broyage, la pointe se rétrécissant vers le bas à 1 pm ou moins. Une fois que les côtés de la pointe ont été blanchi loin, tourner manuellement par 90 ° la tige de NM ensembledepuis l'extérieur de la chambre SEM. Ajustez les modèles polygonaux de fraisage pour s'adapter à la pointe tournée et répéter le fraisage sous un angle différent. Une fois la pointe a été aiguisé à moins de 1 pm, rentrer le NM et insérer l'aiguille du système d'injection de gaz (GIS); repositionner l'aiguille pour être à environ 1 mm au-dessus de la distance de travail (au lieu de l'habituel 175 um). Si l'on utilise un précurseur de Pt, de changer la température de fonctionnement de 24 à 26 ° C (au lieu de l'habituel 40 ° C). Ces mesures sont nécessaires pour cryo-dépôt 13 de la Pt. Ouvrez la chambre SEM et préparer la FIB / SEM pour cryo-mode en montage de la scène de l'échantillon de cryo et l'AC. Mettez le Mexique à la position d'insertion et de connecter ses tresses Cu à l'AC. Assurez-vous de ne pas toucher accidentellement la pointe de NM. Le système est refroidi avec le NM inséré à faire en sorte que la perte de souplesse de la tresse Cu à des températures cryogéniques ne gênera pas le mouvement de NMment. Purger les tuyaux de refroidissement à l'azote sec pendant quelques minutes. Pomper la chambre de préparation de cryo et la chambre d'échantillon principal à un vide poussé. Ajouter l'azote liquide pour refroidir les Dewars deux chambres. Attendez jusqu'à ce que la température désirée est atteinte. 2. Congélation de l'échantillon Montez deux grilles de TEM pour les échantillons FIB sur le support de transfert SEM. Fixez en serrant les vis correspondantes avec un tournevis. Monter un échantillon stub approprié pour l'échantillon et ajouter une partie de l'échantillon. Selon le type d'échantillon, l'échantillon peut être fixé avec de la colle cryogénique ou avec une pince. Utiliser des quantités aussi petites que possible pour garantir une congélation optimale. Monter le support de transfert SEM sur le dispositif de transfert sous vide (VTD). Ajouter de l'azote liquide dans la station de trituration et de la pompe vers le bas pour obtenir la gadoue de l'azote. Ouvrez le slstation de pousant et plongée geler le support de transfert SEM. Pompe à nouveau jusqu'à ébullition est terminée et la neige fondante est obtenu à nouveau. Il convient de noter que l'éthane ou de neige fondante au propane ou le gel à haute pression sont des techniques mieux adaptés pour obtenir la vitrification de l'échantillon. Rétracter le support de transfert SEM dans la chambre à vide de la VTD et la scelle. Purger la station de trituration et la cryo chambre de préparation sas. Assortir le joint VTD avec le sas de la chambre de préparation et de cryo pompe. Quand un niveau de vide bien est atteint, engager l'axe du sas d'ouvrir le sceau de la VTD et le sas extérieur; insérer le support de transfert SEM. Il existe des marquages ​​sur les contacts glissants dans les chambres de préparation indiquant la position de l'échantillon pour la pulvérisation cathodique et la fracturation. Si nécessaire, l'échantillon peut être: fracture avec le couteau froid; sublimé par la mise en température plus élevée (généralement -1006, C); revêtue d'Au / Pd ou Pt par l'intermédiaire de la sputterer froid (300 V, 10 mA, 60 sec pour une 3.2 nm de Au / Pd cap) *. Sublimation ne doit pas être utilisée pour les échantillons vitrifiés pour éviter leur recristallisation. Utilisez le couteau froid pour ouvrir les couvercles de protection des fentes de la grille de TEM. Amener le stade à froid dans la chambre de mesure à la hauteur de réception (16 mm *). Couper le HT sur le FIB / SEM et ouvrir le sas intérieur. Utiliser le VTD pour transférer le support SEM dans la chambre d'échantillon. Gradation de l'éclairage dans la salle peut aider dans cette étape. Une fois que le porte-SEM est dans la phase froide, désengager la VTD en poussant et en tournant. Rétracter la tige VTD tout le chemin dans la chambre à vide VTD et fermer le sas intérieur, le sas extérieur et le joint VTD. Le sas externe peut maintenant être évacué à retirer le joint VTD. Cette dernière étape n'est pas obligatoire, mais il est recommandé que la tige VTD peut être facilement délogé par accident, ce qui peut causer des dommagesà la VTD ou le sas. 3. Ion Fraisage Tournez sur la haute tension sur les deux colonnes et définir les paramètres appropriés d'imagerie (tension d'accélération: 10 kV pour le faisceau d'électrons, 30 kV pour le faisceau d'ions; taille de spot: 3; distance de travail: 5 mm, faisceau d'ions actuelles: 10-100 pA pour l'imagerie, 1-3 nA pour le fraisage) *. Utiliser le faisceau d'électrons pour trouver une caractéristique d'intérêt et pour acquérir des images sur le document de l'état de l'échantillon avant l'extraction de la lamelle. Une fois une région d'intérêt (ROI) pour l'extraction a été identifié, le marquer par un motif de faisceau d'ions, à moins que la topographie de l'échantillon lui-même permet une identification facile du retour sur investissement, même après le dépôt Pt. Pour plus de précision, utilisez la méthode décrite par Pettersson et al. 14 Les inscriptions doivent être profond, large et assez loin pour être toujours visible après avoir été couvert par le dépôt cryo-Pt (qui est non-selcace et couvrira plusieurs mm 2 de la surface de l'échantillon). Chauffer le gaz précurseur à 24-26 ° C et insérer l'aiguille de SIG pour une hauteur d'environ 1 mm au-dessus de la surface de l'échantillon (voir l'étape également 1.3). Bien que l'imagerie par faisceau d'électrons, ouvrir la vanne de gaz pendant quelques secondes. La vitesse de dépôt cryo-Pt est de 100 à 500 nm / s ou plus, en fonction de la distance de l'aiguille d'SIG, la rugosité de l'échantillon et le système de l'utilisateur. Il est recommandé d'effectuer quelques dépôts d'essai pour déterminer les paramètres optimaux. Le dépôt brut cryo-Pt est très rugueuse et homogène. Guérir le dépôt sur le retour sur investissement en utilisant un faisceau d'ions 1000 pA à faible grossissement (par exemple 2000 X). Contrairement au dépôt de cryo, ce site de durcissement est sélectif et ne doit être effectuée sur la seule ROI. Le but de cette première cryo-dépôt est de protéger la surface de l'échantillon contre les dommages par faisceau d'ions et à réduire l'amincissement ionique au cours de frisage 13. Inclinez l'échantillon à52 °, de sorte que la surface est perpendiculaire au faisceau d'ions. Mill distance deux tranchées en terrasses de chaque côté de la ROI. Des dimensions typiques pour les tranchées sont de 20 à 30 um dans la direction (X) parallèle à la lamelle à extraire, de 10 à 15 um dans la direction perpendiculaire (Y) et par une variable, en pente profondeur (Z), avec le point le plus profond près de la ROI. La pente doit être de 45-55 °. Dans certains instruments, tranchées en terrasses ne peuvent être broyées avec le point le plus profond sur le dessus. Dans ce cas, un moulin dans le cadre du retour sur investissement, puis faire pivoter l'image de 180 ° et le moulin le deuxième de l'autre côté. La profondeur de fraisage peut être sélectionné si le taux de la matière de pulvérisation cathodique est connue. Pour la plupart d'échantillon congelé-hydraté, le taux de glace par pulvérisation cathodique peut être utilisé 7. Inclinez l'échantillon à 0 ° et utiliser le faisceau d'ions à couper les côtés et le dessous de la lamelle, en s'assurant que les repères de coupe passent par toute la lamelle (ils devraient laisser des traces de fraisage sur le moulin des pentes en terrassesed à l'étape précédente). Laisser seulement deux petits ponts de liaison de la lamelle vers le reste de l'échantillon. Insérez l'aiguille de SIG (cela peut changer légèrement l'échantillon). Manœuvrer le Mexique jusqu'à la pointe est en contact physique avec la lamelle, de préférence sur le côté. Assurez-vous que le Mexique ne gêne pas la vue du faisceau d'ions des deux petits ponts de liaison. Ouvrir la vanne de SIG pendant quelques secondes et contrôler le dépôt de cryo par imagerie continue avec le faisceau d'électrons. Quand une couche supplémentaire de 1-2 um de Pt a été cryo-déposé, fermer la vanne. Guérir le Pt (voir l'étape 2.6) que dans les quelques um autour du point où le Mexique est en contact avec la lamelle. Utilisez un courant de faisceau ionique élevée pour couper la lamelle libre. Les deux ponts de liaison doivent être broyés à une distance, ainsi que tout excès de Pt qui aurait pu se former de nouveaux points de contact entre la lamelle et le reste de l'échantillon. Ne se rétracte pas encore l'aiguille de SIG. </li> Manoeuvrer avec précaution le NM pour extraire la lamelle de tranchées et de le déplacer au moins 500 um au-dessus de la surface de l'échantillon. Ce n'est qu'après cette étape, rétracter l'aiguille SIG. Abaissez la scène de l'échantillon de quelques mm et le déplacer jusqu'à ce que l'une des grilles de TEM est en vue. Déplacez la zone de fixation sur la grille en position de travail et insérer l'aiguille de SIG. Manoeuvrer avec précaution le NM pour amener la lamelle attachée en contact physique avec la zone de fixation sur la grille de TEM. Il devrait y avoir aucune pression ou de tension entre la lamelle, la grille de TEM et le Mexique. Ouvrez le robinet de gaz pour quelques secondes et cryo-dépôt d'une couche supplémentaire de 1-2 um de Pt. Guérir le Pt (voir l'étape 2.6) que dans les quelques um autour du point de contact entre la lamelle et la grille de TEM. Utilisez un courant de faisceau ionique élevée pour couper la lamelle libre de la NM. Ceci peut être réalisé par broyage à une distance de l'une ou l'autre extrémité de la NM ou le côté de l'échantillon. En til premier cas, la pointe devra être affûté à nouveau avant la prochaine utilisation, comme décrit dans l'étape 1.2. OPTION: à ce stade, il est possible d'utiliser le VTD de prendre la porte de transfert SEM et stocker O / N dans un Dewar rempli d'azote liquide. Ce transfert et O / N stockage est susceptible de provoquer la formation de glace sur la surface de la lamelle, si les cristaux de glace sont déjà présentes et / ou si l'azote liquide est exposé à de l'air humide; mais une telle contamination sera supprimé par la prochaine étape dans un temps relativement court. Comme les étapes précédentes ont peut-être pris plusieurs heures pour terminer, il pourrait être approprié de le faire, puisque, après l'étape suivante tel stockage O / N n'est pas recommandé, car il n'y aurait aucun moyen de supprimer la contamination de glace sauf par sublimation (qui ne peut pas être effectué si la vitrification de l'échantillon doit être maintenue). Inclinez l'échantillon à 52 ° et d'utiliser le faisceau d'ions de mince à électrons transparence 7. Il est recommandé de commencer avec une plus grande, rougses courants de faisceau de supprimer l'essentiel et de procéder à une amende polissage de la surface avec des courants de poutre inférieure, réduisant éventuellement aussi la tension d'accélération. L'épaisseur finale de la lamelle doit être de 100 à 200 nm ou moins pour l'analyse de l'ultrastructure de 100 à 200 kV dans un TEM ou jusqu'à 500 nm pour une tomographie à 300 kV TEM, en fonction de la composition de l'échantillon. Lors de l'amincissement, les contraintes internes de l'échantillon peuvent causer la lamelle se gondoler ou de se tordre. Dans un tel cas, la région amincie doit être limité. Cela s'est produit par exemple dans les Figures 11 et 12. 4. Cryo transfert de TEM Rincer la station cryo-transfert avec de l'azote gazeux sec pendant quelques minutes. Ajouter l'azote liquide pour le Dewar de la TEM AC et de la gare cryo-transfert. Insérez le support de cryo-MET transfert dans la fente appropriée de la station cryo-transfert et remplir son Dewar ainsi. Attendez jusqu'à ce que chaque échantillononent a atteint la température souhaitée (environ 15 min). Si possible, le dispositif de commande du support de cryo-TEM transfert doit être connecté pour contrôler la température au cours du transfert. Il est important de se rendre compte que la pointe du support de TEM (où le capteur de température est situé) sera en contact avec la station cryo-transfert et ne sera donc refroidir beaucoup plus rapidement que le reste du support de TEM. Il est donc recommandé que le temps nécessaire pour l'ensemble du support de cryo-TEM transfert à refroidir est mesurée au préalable, et que le système est autorisé à thermaliser au moins pour ce laps de temps. Remplissez une tasse cryogénique à l'azote liquide et plonger en elle: l'outil TEM échantillon de serrage, un tournevis et une pince à épiler, afin de refroidir leurs conseils à la température désirée. Tous les outils doivent être correctement isolés à l'autre extrémité afin de ne pas causer des brûlures à froid à la main de l'opérateur. Correspondre à la VTD au sas extérieur. Apportez le cerf froide à la hauteur de transfert (16 mm *). Désactiver la haute tension. Ouvrez le sceau VTD, le sas extérieur et intérieur du sas. Utiliser la tige VTD pour verrouiller dans le support de transfert SEM en poussant et en tournant dans le sens horaire. Rétracter le support de transfert SEM dans la chambre de préparation cryo. Utilisez le couteau froide pour refermer les couvercles de protection des grilles de TEM. Cela est nécessaire pour réduire la contamination de glace possible pendant le transfert. Utiliser la tige VTD pour déplacer l'échantillon dans la chambre à vide de la VTD. Fermez les sas et joint. Purger le sas extérieur et détacher le VTD. Correspondre à la VTD au port SEM de la station cryo-transfert. Sous balayage d'azote sec, utiliser la broche sur la station d'ouvrir le sceau de la VTD et faites glisser le support de transfert SEM dans le Dewar de la station cryo-transfert. Ajouter suffisamment d'azote liquide de sorte que le niveau dans la station cryo-transfert est suffisamment élevéejuste plonger l'échantillon. Utilisez le tournevis préalablement refroidie à ouvrir l'un des couvercles et desserrer la vis correspondant qui maintient la grille de TEM en place. Utilisez la pince à épiler préalablement refroidie à ramasser la grille de TEM et le placer dans le support de TEM. Utiliser le hexring refroidi pour fixer la grille de TEM sur le support de TEM. Fermez le volet du support de cryo-MET transfert. L'étape de transfert des échantillons est cruciale et peut être entravée par de l'azote gazeux en réduisant la visibilité du petit échantillon TEM. Débrancher la station de cryo-transfert à partir du système de pompage et de le transporter à proximité de la TEM, conjointement avec le contrôleur de dispositif de chauffage du support de cryo-TEM transfert. Démarrer la pompe turbo-moléculaire de la TEM pour pomper la ligne de support pour le sas TEM. Réglez le stade de l'échantillon de TEM à une inclinaison de -70 ° *. Régler le temps le plus court de pompage pour le sas (30 à 60 sec), avec un seul cycle de rinçage avec un gaz d'azote sec. </li> Assurez-vous que le volet de protection sur le support de cryo-MET transfert est fermée. Retirez le support de TEM de la station cryo-transfert et l'insérer dans le goniomètre incliné (azote liquide se renverse du Dewar porte-TEM). Le cycle de pompage commence. Une fois que le cycle est terminé, régler le goniomètre pour incliner à 0 ° et, en même temps, maintenir le support de TEM pour qu'il ne tourne pas avec le goniomètre. Insérez complètement à l'intérieur du TEM. Au cours de cette étape, le support de cryo-TEM transfert doit être relié à son dispositif de commande de réchauffeur pour contrôler la température. La procédure pour insérer le porte-échantillon dans le TEM peut varier entre différents modules thermoélectriques. Il est donc recommandé de contacter le fabricant de TEM pour obtenir la procédure appropriée. Remplissez le cryo-transfert titulaire TEM Dewar. Attendez que le vide dans le TEM pour atteindre un niveau acceptable.