استعمال اللوني للغاز لتحليل التغييرات التركيبية من الأحماض الدهنية في الفئران الكبد الأنسجة أثناء الحمل
Summary
الحمل يؤدي إلى تغييرات كبيرة في تكوين الأحماض الدهنية من الأنسجة الأمهات. ويمكن الحصول على ملامح من المادة الدهنية عبر اللوني للغاز للسماح تحديد وتقدير الأحماض الدهنية في الطبقات الدهنية الفردية بين الفئران التي تغذت مختلف الوجبات الغذائية عالية الدهون ومنخفضة خلال فترة الحمل.
Abstract
اللوني للغاز (GC) هو وسيلة حساسة للغاية يستخدم لتحديد وقياس محتوى الأحماض الدهنية من الدهون من الأنسجة، والخلايا، والبلازما / مصل، مما أسفر عن النتائج بدقة عالية واستنساخ عالية. في دراسات التمثيل الغذائي والتغذية يسمح GC تقييم التغيرات في تركيزات الأحماض الدهنية التالية تدخلات أو خلال التغيرات في الحالة الفسيولوجية مثل الحمل. المرحلة الصلبة استخراج (SPE) باستخدام خراطيش أمينو السيليكا يسمح الفصل بين الطبقات الدهنية الرئيسية بما في ذلك زعت عشوائيا إلى ثلاثة، الدهون الفوسفاتية المختلفة، واسترات الكوليسترول (CE). تم استخدام GC جنبا إلى جنب مع جمعية مهندسي البترول لتحليل التغيرات في تكوين الأحماض الدهنية من جزء CE في كبد الفئران الحوامل البكر والتي تم تغذيتها مختلف الوجبات الغذائية العالية والمنخفضة الدهون. هناك آثار التفاعل حمية / الحمل كبير على محتوى حمض أوميغا 3 و أوميغا 6 الدهنية من الكبد CE، مشيرا إلى أن الإناث الحوامل لديهم استجابة مختلفة لmanipulat الغذائيةوينظر أيون من بين الإناث البكر.
Introduction
اللوني للغاز (GC) هي تقنية راسخة المستخدمة لتحديد وقياس إدماج الأحماض الدهنية في تجمعات الدهون وأغشية الخلايا 1،2 خلال مكملات أو الفسيولوجية الظروف مثل السمنة (والأمراض ذات الصلة مثل مرض السكري) أو الحمل 3 – 5. بل هو أيضا مناسبة لتحليل أنواع وكميات الدهون في الأطعمة. هذا مفيد عندما تميز العلائق، وكذلك التأكد من أن صناعة المواد الغذائية يتوافق مع اللوائح. على سبيل المثال، GC يمكن استخدامها لتأكيد هوية وكمية من الأحماض الدهنية داخل منتج مثل المكملات الغذائية لضمان وضع العلامات هو الصحيح، ويتم الالتزام اللوائح إلى 6،7. تحليل الأحماض الدهنية يمكن أن توفر معلومات قيمة حول التمثيل الغذائي للدهون في الصحة والمرض، وتأثير تغيير النظام الغذائي، وتأثير التغيرات في الحالة الفسيولوجية 8. وقد وفرت استخدام GC لدراسة عينات خلال فترة الحمل مهمةمعلومات عن التغيرات في الأحماض الدهنية والدهون المعقدة التوازن 3.
في وقت مبكر من الفصل الكروماتوغرافي، وعادة ما تكون نسبة الدهون المستخرجة من العينة باستخدام ذوبان الدهون في مخاليط المذيبات من الكلوروفورم والميثانول. يتم إضافة كلوريد الصوديوم إلى تسهيل فصل الخليط في الدهون المائية والعضوية التي تحتوي مراحل 9،10. يمكن فصل الطبقات الدهنية المعقدة من الاهتمام من مجموع استخراج الدهون من خلال المرحلة الصلبة استخراج (SPE). هذه التقنية فصل elutes الطبقات الدهنية على أساس قطبية أو تقارب ملزمة. ومزال Triacyglycerols (TAG) واسترات الكوليسترول (CE) أولا ككسر مجتمعة، كذلك الطبقات، فسفاتيديل (PC)، فسفاتيديل (PE)، والأحماض الدهنية غير تجمعت (NEFA) ومزال عن طريق زيادة قطبية المذيب يبلغ حجمه . فصل TAG من CE يستغل الملزمة TAG فقط لخراط SPE جديدةDGE، مما يسمح CE أن مزال. ويمكن بعد ذلك أن TAG مزال عن طريق زيادة قطبية المذيب 9،10 يبلغ حجمه. يسمح هذا الأسلوب يتحقق عينات متعددة في وقت واحد لا يمكن فصلها مع تحقيق عائد أعلى من مع طبقة رقيقة اللوني، مما يعني أن عينات صغيرة نسبيا الحجم (على سبيل المثال <البلازما أو مصل 100 ميكرولتر، <100 ملغ الأنسجة) يمكن تحليلها 11،12.
GC هي تقنية راسخة وصف لأول مرة في 1950s؛ اقترح أن الطور المتحرك في النظم ثم السائل السائل يمكن الاستعاضة مع بخار. انه كان يستخدم في البداية لتحليل البترول ولكن توسعت بسرعة في مجالات أخرى مثل تحليل الأحماض الأمينية والدهون الكيمياء الحيوية، والتي لا تزال ذات أهمية كبرى. وقد أدى التقدم في المعدات والتكنولوجيا GC مثل وضع الأعمدة الشعرية من الأعمدة معبأة المستخدمة سابقا إلى التقنيات الحالية لدينا في الأحماض الدهنية التي هي قادرة على أن تكونفصل أكثر كفاءة في درجات حرارة أقل مما أدى إلى GC تستخدم بشكل روتيني لتحديد وقياس الأحماض الدهنية في مجموعة واسعة من التحقيقات 13.
يتطلب GC الأحماض الدهنية أن derivatized من اجل ان يتمكنوا قد تصبح متقلبة بما فيه الكفاية ليكون مزال في درجات حرارة معقولة دون التحلل الحراري. هذا وعادة ما ينطوي على الاستعاضة عن مجموعة وظيفية تحتوي على الهيدروجين لتكوين استرات، thioesters أو الأميدات للتحليل. ودرس استرات الميثيل عادة المشتقات التي يتم إنتاجها من قبل مثيلة. في هذا الأسلوب يتم تحلل السندات استر في الدهون المعقدة للافراج عن الأحماض الدهنية الحرة، والتي transmethylated لتشكيل استرات الأحماض الدهنية الميثيل (FAME). الملف الشخصى الناتجة من FAME، والتي تحددها القيادة العامة، ويشار إليها باسم تكوين الأحماض الدهنية، ويمكن بسهولة مقارنة بين المجموعات التجريبية المختلفة 9،10. يسمح للتقنية كل من نسب individالأحماض الدهنية السياقية وتركيزاتها المراد قياسها.
بالإضافة إلى استخدام GC لتحليل الأحماض الدهنية في دراسات التغذية وداخل صناعة الأغذية، وتقنية يمكن استخدامها عبر مجموعة واسعة من المجالات التحليلية. على سبيل المثال، التحليلات البيئية باستخدام GC تشمل قياس تلوث المياه من خلال المبيدات الحشرية والتربة تحاليل قياس محتوى كلوروبنزين. في علم السموم، كما تم استخدام GC لتحديد المواد غير المشروعة في البول وعينات الدم من الأفراد؛ مثل هذه القدرة على الأداء الرياضي 12 والقدرة على فصل مخاليط معقد من الهيدروكربونات يجعل هذه التقنية شعبية في الصناعة النفطية لتحليل البتروكيماويات 12.
ويرتبط الحمل مع تغييرات كبيرة في تكوين الأحماض الدهنية من الأنسجة الأمهات، وتحديدا في محتوى أوميغا 3 (ن 3) وأوميغا 6 (ن 6) غير المشبعة المجلس الدولي للمطارات الدهنيةس (بوفا) 3. في الدراسة الحالية، ونحن مثالا على استخدام GC في قياس الأحماض الدهنية من خلال وصف استخدامه في تحليل تكوين الأحماض الدهنية من الأنسجة المأخوذة من الكبد الفئران الحوامل البكر وتغذية حمية منخفضة الدهون وعالية مع مصادر النفط المختلفة. كانت العلائق المقدمة هنا على النفط على أساس نظام غذائي منخفض الدهون فول الصويا، اتباع نظام غذائي عالي الدهون التي تعتمد على النفط فول الصويا (130.9 ز الدهون / كجم من الدهون الكل) أو اتباع نظام غذائي تعتمد على النفط بذر الكتان غنية بالدهون (130.9 ز الدهون / كجم النظام الغذائي)، شريطة لمدة 20 يوما. وقد وصفت والمواد الغذائية كاملة وتكوين الأحماض الدهنية من هذه الوجبات سابقا 14. الوجبات الغذائية زيت فول الصويا غنية في حمض اللينوليك (18:02 ن 6) وتحتوي على بعض حمض اللينولينيك α (18:03 ن 3) في حين أن اتباع نظام غذائي زيت بذر الكتان غنية في حمض اللينولينيك-α. تمثل هذه الوجبات الغنية بالدهون حصص مختلفة من اللينوليك إلى α لينولينيك والأحماض (حصص من 8:1 و 1:1 على التوالي). طريقة لعزل الطبقات الدهنية الفردية وتحليلها بواسطة GC هو أنناليرة لبنانية أنشئت والتحقق من صحتها، وقد نشرت سابقا 10 ولكن من دون صفا تقنيا مفصلا وجدت في هذه الوثيقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
اللوني للغاز هو أسلوب دقيق لاستخدامها لتحليل الأحماض الدهنية، ويرى استنساخ العالية هذه التقنية مناسبة للالتحليلات السريرية. يجب استخدام الأعمدة GC المناسبة لتمكين تحديد الأحماض الدهنية من الفائدة، مع وجود اختلافات الأعمدة المتوفرة في قطبية الطور الثابت، طول العمو…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن نعترف بمساهمة Meritxell روميو ونادال لدراسة الفئران.
Materials
| Methanol: | Fisher Scientific | M/4056/17 | 'CAUTION' Fumes – HPLC Grade |
| Chloroform: | Fisher Scientific | C/4966/17 | 'CAUTION' Fumes – HPLC Grade |
| BHT: | Sigma- Aldrich | W218405 | 'CAUTION' Dust fumes – Anhydrous |
| NaCl | Sigma- Aldrich | S9888 | Anhydrous |
| Hexane | Fisher Scientific | H/0406/17 | 'CAUTION' Fumes – HPLC Grade |
| Glacial acetic acid | Sigma- Aldrich | 695084 | 'CAUTION' Burns – 99.85% |
| Sulfuric acid | Sigma- Aldrich | 339741 | 'CAUTION' Burns – 99.999% |
| Potassium carbonate | Sigma- Aldrich | 209619 | 99% ACS Reagent grade |
| Potassium bicarbonate | Sigma- Aldrich | 237205 | 99.7% ACS Reasgent grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10204340 | 'CAUTION' Fumes – 99+% GLC SpeciFied |
| Toluene | Fisher Scientific | T/2300/15 | 'CAUTION' Fumes |
| Diethyl ether | Sigma- Aldrich | 309966 | 'CAUTION' Fumes |
| Nitrogen (oxygen free) cylinder | BOC | 44-w | 'CAUTION' Compressed gas – explosion risk |
| Aminopropyl silica SPE cartridges | Agilent | 12102014 | Cartridge – Bead mass 100mg |
| Silica gel SPE cartidges | Agilent | 14102010 | Cartridge – Bead mass 100mg |
| Molecular seives | Sigma- Aldrich | 334324 | Pellets, AW-300, 1.6mm |
| Glass pasteur pipettes | Fisher Scientific | FB50251 | |
| Borosilicate glass test tube | Fisher Scientific | FB59527 | Non-screw cap |
| Screw thread glass test tubes | Fisher Scientific | FB59555 | 13mm |
| Caps for screw thread test tubes | Fisher Scientific | FB51353 | To fit 13mm tube |
| Solida phase extraction (SPE) tank | Agilent | VacElut 20 Manifold | |
| Luer stopcocks for SPE tank | Agilent | 12131005 | |
| Vacuum pump | Sigma- Aldrich | 2656-194GB-1EA | |
| GC vials | Kinesis | STV 12-03TS | Short thread 9mm, TPX 0.2ml fused glass insert |
| GC vial lids | Kinesis | SCC09-0.2B | Short thread 9mm blue |
| GC inlet liners | SGE Analytical science | 092002 | Split/splitless Focus liner ID 4mm, OD 6.3mm length 78.5mm |
| GC septa | SGE Analytical science | 041856 | 11mm, MN material |
| GC column | SGE Analytical science | 054612 | Length 30m, ID 0.22mm, Film thickness 0.25µm |
| Gas chromatograph | HP 6890 series |
References
- Browning, L. M., et al. Incorporation of eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids into lipid pools when given as supplements providing doses equivalent to typical intakes of oily fish. Am. J. Clin. Nutr. 96 (4), 748-758 (2012).
- Cao, J., Schwichtenberg, K. A., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y. Incorporation and clearance of omega-3 fattyacids in erythrocyte membranes and plasma phospholipids. Clin. Chem. 52 (12), 2265-2272 (2006).
- Lauritzen, L., Carlson, S. E. Maternal fatty acid status during pregnancy andlactation and relation to newborn and infant status. Matern. Child Health. 7 (2), 41-58 (2011).
- Kelsall, C. J., et al. Vascular dysfunction induced in offspring by maternal dietary fat involves altered arterial polyunsaturated fatty acid biosynthesis. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Karpe, F., Dickmann, J. R., Frayn, K. N. Fatty acids, obesity, and insulin resistance: time for a re-evaluation. Diabetes. 60 (10), 2441-2449 (2011).
- Mossoba, M. M., Moss, J., Kramer, J. K. Trans fat labelling and levels in U.S. foods: assessment of gas chromatographic and infrared spectroscopic techniques for regulatory compliance. J. AOAC Int. 92 (5), 1284-1300 (2009).
- Chee, K. M., et al. Fatty acid content of marine oil capsules. Lipids. 25 (9), 523-528 (1990).
- Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
- Burdge, G. C., Wright, P., Jones, E. A., Wootton, S. A. A method for separation of phosphatidylcholine, triacylglycerol, non-esterified fatty acids and cholesterol esters from plasma by solid-phase extraction. Br. J. Nutr. 84 (5), 781-787 (2000).
- Seppänen-Laakso, T., Laakso, I., Hiltunen, R. Analysis of fatty acids by gas chromatography, and its relevance to research on health and nutrition. Anal. Chim. Acta. 465 (1), 39-62 (2002).
- Beesley, T. E., Buglio, B., Scott, R. P. W. . Quantitative chromatographic analysis. , (2000).
- Bartle, K. D., Myers, P. History of gas chromatography. Trends Anal. Chem. 21 (9), 9-10 (2002).
- Childs, C. E. . The effect of gender, pregnancy and diet upon rat tissue fatty acid composition and immune function. , 378 (2008).
- Harris, S. W., Pottala, J. V., Ramachandran, S. V., Larson, M. G., Robins, S. J. Changes in erythrocyte membrane Trans and marine fatty acids between 1999 and 2006 in older Americans. J. Nutr. 142 (7), 1297-1303 (2012).
- Roberts, L. D., McCombie, G., Titman, C. M., Griffin, J. L. A matter of fat: An introduction to lipidomic profiling method. J. Chromatogr. B. 871 (2), 174-181 (2008).
