Préparation de neurones co-cultures avec l'unité portable de précision

Tissu neuronal est très complexe; un mélange cellulaire hétérogène spatialement ordonné dans des couches et des compartiments définis et avec une connectivité plastique par des contacts cellulaires et en particulier par l'intermédiaire des axones et dendrites excroissances. De nouvelles techniques sont nécessaires pour conférer une plus grande liberté d'expérimentation pour gagner une compréhension plus profonde et mécanismes démêler centrales à la maladie, le développement et la fonction saine. La chambre Campenot ^1,2 et, plus récemment, des modes de réalisation microfabriqué ^3,4 peuvent être utilisés pour la préparation ex vivo des co-cultures de neurones en réseau ayant la capacité de perturber sélectivement les différentes populations somatiques et également leurs excroissances de neurites. Ces dispositifs microfluidiques ont par exemple été utilisés pour étudier la dégénérescence axonale et la régénération chimique suivante ^5,6 ou laser axotomie ^6-8, tauopathie ^9, la diffusion virale ^10,11, et la localisation des ARNm dans les axones ^4.

ent ">

Pour étendre la portée des neurobiologistes, les développements technologiques sont nécessaires pour préparer les co-cultures de neurones minimalistes. Cela permet désenchevêtrement du réseau neuronal pour l'étude du système avec une seule cellule et une précision sub-cellulaire. L'obligation pour les nombres de cellules minimaux ouvre la possibilité d'analyser les différents types de cellules rares, y compris les cellules de la substantia nigra dopaminergiques pertinents pour la maladie de Parkinson, les ganglions de la spirale de l'oreille, des neurones périphériques, et les cellules souches. Au-delà, l'économie cellulaire est pertinente à l'initiative 3R. L'utilisation de ces plates-formes microfluidiques, des écrans de toxicité à grande échelle ou d'autres haut débit, riche en données série expérimentale nécessitant des neurones des animaux peut maintenant être considérée.

Dans ce document, les protocoles pour la fabrication et l'utilisation d'un dispositif microfluidique sont décrits. Formation de réseau microfluidique en combinaison avec un biomateri in situProcédé de formation de motifs al peut être utilisé pour l'enregistrement des co-cultures de neurones fortement interconnectés en utilisant les nombres de cellules minimal. Formation de réseaux microfluidique est basé sur une approche de flux différentiel ^12-15, où les pièges microstructurées sont placés dans un circuit fluidique (illustré avec des images MEB de la figure 1). Le chemin 0 → 1 présente la plus faible résistance fluidique (R _2> R ₁₎ pour le transport de neurones à une rangée linéaire d'ouvertures microstructurées – les ports d'entrée vers les canaux de la croissance des neurites. Occupation du piège par une seule cellule empêche localement le flux de détourner les lignes de courant pour piéger les cellules suivantes dans les pièges voisins. Occupation totale des pièges contenus dans le tableau commute le rapport fluidique (R _1> R ₂₎ pour dévier les lignes de courant dans le trajet sinueux (0 → 2) pour produire un mode de fonctionnement en dérivation pour l'élimination des excès de neurones.

<p class = "jove_content" fo: keep-together.within page = "always">
Figure 1. Microfluidique circuit. A) Le circuit de résistance différentielle fluidique pour seule formation de réseaux de neurones, avec accompagnement des chambres de culture reliés entre eux par des canaux de la croissance des neurites. B, C images) au MEB de la bicouche neurone compartimentée matrice de co-culture avec des ménisques micropiliers goupiller. Avec cette conception, structures neurone piégeage en forme de trident ont été utilisés pour promouvoir fasciculation des excroissances de neurites. Figure et légende reproduit avec la permission de la Royal Society of Chemistry (RSC) ^12. Cliquez ici pour agrandir l'image.

La préparation des réseaux neuronaux microélectrodes sur des substrats planaires peut facilement être atteint (pour exampl es de notre groupe, voir Frimat et al. ¹⁶ et Heike et al. ^17). Cependant, l'encapsulation des motifs de matériau bioactif dans des dispositifs PDMS et à l'exigence d'alignement échelle micrométrique de ceux-ci aux canaux microfluidiques pose un défi technique majeur. Dans la section 3.1 un protocole pour l'en-puce, ou in situ, la préparation de modèles de biomatériaux est présenté. Ces modèles permettent l'enregistrement des neurones pendant de longues échelles de temps de la culture et de promouvoir des excroissances entre les compartiments. Microstructures ménisque-épinglage sont utilisées pour aligner une dite masque de l'eau avec le neurone sites et des canaux de l'excroissance de neurites rangeant. Le masque protège les revêtements de l'eau des molécules d'adhésion pendant le traitement au plasma, tandis que les surfaces exposées sont désintégrées pour définir le motif de biomatériau. En outre, les protocoles sont prévus pour la culture de cellules et pour l'isolation fluidique nécessaire pour le traitement sélectif des différents compartiments de co-culture.

ve_content "> Les protocoles sont conçus pour tirer parti des principes conviviales de lithographie douce pour la réplication de poly (diméthyl) (PDMS) des dispositifs microfluidiques ^18. De même, biomatériau in situ structuration en est simple, l'exploitation évaporation de surface et les phénomènes de tension, et seulement nécessitant une source de plasma portatif peu coûteux. Circuit microfluidique efficacement les traitements spécifiques des programmes de chargement de la cellule et des soutes qui rend ces opérations simplement une question de la distribution des matériaux dans l'orifice inférieur correspondant et l'aspiration par le haut. De cette manière, il est destiné à donner les neurobiologistes la liberté de préparer et d'utiliser des dispositifs microfluidiques dans leurs propres laboratoires.