Un protocollo per l'analisi dell'epatite C replicazione del virus
Summary
Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.
Abstract
Virus dell'epatite C (HCV) colpisce il 3% della popolazione mondiale e provoca gravi disturbi epatici, tra cui epatite cronica, cirrosi e carcinoma epatocellulare. HCV è un virus a RNA enveloped appartenente alla famiglia Flaviviridae. Terapia attuale non è pienamente efficace e provoca effetti collaterali negativi. Non esiste un vaccino HCV disponibili. Pertanto, è necessaria continuato sforzo per sviluppare un vaccino e migliore terapia. Un sistema di coltura cellulare HCV è fondamentale per studiare varie fasi di crescita HCV tra cui l'ingresso del virus, la replicazione del genoma, imballaggio e uscita. Nella procedura attuale presentata, abbiamo utilizzato un virus wild-type intragenotype 2a chimerico, FNX-HCV, e un virus ricombinante FNX-Rluc portando un Renilla luciferasi gene reporter per studiare la replicazione del virus. Una linea di cellule di epatoma umano (Huh-7 riferiscono) è stato utilizzato per la trasfezione in vitro di trascritti HCV RNA genomici. Surnatanti di coltura privi di cellule, lisati proteici e tRNA otale sono state raccolte in vari momenti punti post-trasfezione per valutare la crescita HCV. HCV stato replicazione del genoma è stata valutata mediante RT-PCR e visualizzando la presenza di HCV RNA a doppio filamento. L'espressione della proteina di HCV è stata verificata da blot e immunofluorescenza saggi occidentali utilizzando anticorpi specifici per le proteine HCV NS3 e NS5A. Cellule trasfettate HCV RNA rilasciate particelle infettive nella cultura surnatante e il titolo virale è stato misurato. Saggi di luciferasi sono stati utilizzati per valutare il livello di replicazione e infettività di HCV giornalista. In conclusione, vi presentiamo vari saggi virologici per la caratterizzazione delle diverse fasi del ciclo di replicazione di HCV.
Introduction
Virus dell'epatite C (HCV) causa cirrosi e cancro del fegato. Essa colpisce 170 milioni di persone in tutto il mondo con 350.000 persone muoiono ogni anno 1-3. HCV è un virus a RNA filamento positivo con un genoma di 9,6 kb. Il genoma di HCV è tradotto come singola poliproteina di ~ 3000 residui amminoacidici che viene scissione proteolitica da varie proteasi cellulari e virali in 10 polipeptidi. HCV è il virus prototipo in genere Hepacivirus e appartiene alla famiglia Flaviviridae 4. Dopo l'esposizione, HCV stabilisce infezione cronica nel 80% degli individui. L'infezione è prevalentemente asintomatica e tempestiva diagnosi può consentire l'intervento terapeutico per prevenire il deterioramento del fegato. Il trattamento attuale è ottimale e nessun vaccino è disponibile 5,6.
L'eziologia di epatite C è stata descritta per la prima nel 1989 7. Studiare la replica di HCV è importante per il vaccino contro l'epatite C e la ricerca del trattamento, ma era statolungo ostacolata dalla mancanza di un efficiente sistema di coltura virale. Un clone molecolare di HCV ha dimostrato di essere contagiosa negli scimpanzé su inoculazione intraepatica 8. Successivamente, sono stati descritti repliconi HCV sub-genomici, che ha permesso di sezionare la fase di replicazione del genoma virale in un sistema di coltura cellulare 9,10. Scoperta di un HCV genotipo 2a isolare JFH-1 (Giapponese epatite fulminante-1), in grado di infettare colture cellulari ha aperto nuove strade per la ricerca replicazione di HCV 11-13. Ceppo genotipo 2a JFH-1 sistemi di coltura infettive basati basati virus chimerici inter-e intra-genotipiche e genotipo 1 HCV sono disponibili pure 14-18.
Abbiamo utilizzato con successo JFH-1 ceppo e HCV intragenotype 2a virus chimerico avere la ad alta risoluzione profili funzionali mappa di domini di proteine e cis-acting elementi RNA 19,20. In base a questo, qui si descrive un sistema efficace cultura utilizzato di routine che permettestudiando varie fasi del ciclo di replicazione di HCV e l'interazione ospite-patogeno. Vi presentiamo saggi virologici per valutare la replicazione del genoma virale e infettività de novo di intragenotype 2a HCV e un giornalista HCV basata Renilla luciferasi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questa illustrazione descrive un metodo per analizzare il ciclo di replicazione del virus dell'epatite C. HCV è un agente patogeno umano e il protocollo sulla biosicurezza prescritta dovrà essere seguite scrupolosamente. Sistemi di coltura di cellule HCV infettive sono state descritte in precedenza 11-13,16,17. Ci sono alcuni punti cruciali attuiamo quando seguendo il protocollo illustrato. In primo luogo, è di grande importanza per avere una buona qualità di intatta tutta la lunghezza RNA genomico vi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank F. Chisari for providing Huh-7.5.1 cell line. We would like to thank Justine Ho for editing the manuscript. This work was supported by Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award and National Center for Advancing Translational Sciences, Grant UL1TR000124 to V.A.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Non essential amino acid | Fisher Scientific | MT25025CI | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red | Life Technologies | 11058-021 | |
| Huh-7.5.1 | The Scripps Research Institute | The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center | |
| Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null) | Cedars-Sinai Medical Center | The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides. | |
| XbaI | New England Biolabs Inc. | R0145S | |
| Mung Bean Nuclease | New England Biolabs Inc. | M0250S | |
| T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Electroporation Cuvette (4 mm) | Bioexpress | E-5010-4 | |
| Gene Pulser Xcell Total System | Bio-Rad | 165-2660 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11008 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| PVDF membrane package | Bio-Rad | 162-0263 | |
| Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk | Bio-Rad | 170-6404XTU | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531XTU | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2] | Abcam | ab65407 | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23] | Abcam | ab13830 | |
| Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-035-003 | |
| Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents | GE Healthcare Life Sciences | RPN2236 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| ViiA 7 real-time PCR system | Life Technologies | NA | |
| Renilla Luciferase Assay System kit | Promega | E2810 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| GloMax-Multi Detection System (Luminometer) | Promega |
References
- Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C. Hepatology.. 26(3 Suppl 1), (1997).
- Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).
- Lavanchy, D. The global burden of hepatitis C. Liver Int. 29 (Suppl 1), 74-81 (2009).
- Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. . Flaviviridae: viruses and their replication in Fields Virology. , 1101-1152 (2007).
- Ciesek, S., Manns, M. P. Hepatitis in 2010: the dawn of a new era in HCV therapy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (2), 69-71 (2011).
- Ghany, M. G., et al. An update on treatment of genotype 1 chronic hepatitis C virus infection: 2011 practice guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 54 (4), 1433-1444 (2011).
- Choo, Q. L., et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 244 (4902), 359-362 (1989).
- Kolykhalov, A. A., et al. Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA. Science. 277 (5325), 570-574 (1997).
- Lohmann, V., et al. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science. 285 (5424), 110-113 (1999).
- Blight, K. J., Kolykhalov, A. A., Rice, C. M. Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture. Science. 290 (5498), 1972-1974 (2000).
- Lindenbach, B. D., et al. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science. 309 (5734), 623-626 (2005).
- Wakita, T., et al. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat Med. 11 (7), 791-796 (2005).
- Zhong, J., et al. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (26), 9294-9299 (2005).
- Yi, M., et al. Compensatory mutations in E1, p7, NS2, and NS3 enhance yields of cell culture-infectious intergenotypic chimeric hepatitis C virus. J Virol. 81 (2), 629-638 (2007).
- Pietschmann, T., et al. Construction and characterization of infectious intragenotypic and intergenotypic hepatitis C virus chimeras. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7408-7413 (2006).
- Li, Y., et al. Highly efficient full-length hepatitis C virus genotype 1 (strain TN) infectious culture system. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19757-19762 (2012).
- Yi, M., Lemon, S. Genotype 1a HCV (H77S) infection system. Methods Mol Biol. 510, 337-346 (2009).
- Gottwein, J. M., et al. Development and application of hepatitis C reporter viruses with genotype 1 to 7 core-nonstructural protein 2 (NS2) expressing fluorescent proteins or luciferase in modified JFH1 NS5A. J Virol. 85 (17), 8913-8928 (2011).
- Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathog. 4 (10), (2008).
- Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
- Salloum, S., et al. Rab18 binds to hepatitis C virus NS5A and promotes interaction between sites of viral replication and lipid droplets. PLoS Pathog. 9 (8), (2013).
- Gonzalez, G., et al. Selection of an optimal RNA transfection reagent and comparison to electroporation for the delivery of viral RNA. J Virol Methods. 145 (1), 14-21 (2007).
- Phan, T., et al. Hepatitis C virus NS2 protein contributes to virus particle assembly via opposing epistatic interactions with the E1-E2 glycoprotein and NS3-NS4A enzyme complexes. J Virol. 83 (17), 8379-8395 (2009).
- Schaller, T., et al. Analysis of hepatitis C virus superinfection exclusion by using novel fluorochrome gene-tagged viral genomes. J Virol. 81 (9), 4591-4603 (2007).
- Li, R., et al. Production of hepatitis C virus lacking the envelope-encoding genes for single-cycle infection by providing homologous envelope proteins or vesicular stomatitis virus glycoproteins in trans. J Virol. 85 (5), 2138-2147 (2011).
- Jones, C. T., et al. Hepatitis C virus p7 and NS2 proteins are essential for production of infectious virus. J Virol. 81 (16), 8374-8383 (2007).
- Steinmann, E., et al. Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly and release of infectious virions. PLoS Pathog. (7), (2007).
