Ein Protokoll für die Analyse von Hepatitis-C-Virus-Replikation
Summary
Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.
Abstract
Hepatitis-C-Virus (HCV) betrifft 3% der Weltbevölkerung und verursacht schwere Lebererkrankungen wie chronische Hepatitis, Leberzirrhose und Leberzellkarzinom. HCV ist ein umhülltes RNA-Virus aus der Familie Flaviviridae. Strombehandlung nicht wirksam ist und bewirkt, dass nachteilige Nebenwirkungen. Es gibt keine HCV-Impfstoff zur Verfügung. So wird fortgesetzt Aufwand für die Entwicklung eines Impfstoffes und eine bessere Therapie erforderlich. Einem HCV-Zellkultursystems ist kritisch für das Studium verschiedener Stadien der HCV Wachstum einschließlich Viruseintritt, Genom-Replikation, Verpackung und Austritt. In der vorgestellten aktuellen Prozedur verwendeten wir eine Wildtyp-intragenotype 2a chimären Virus, FNX-HCV, und ein rekombinantes FNX-Rluc Virus, eine Renilla-Luciferase-Reportergens um die Virusreplikation zu studieren. Eine menschliche Hepatom-Zelllinie (Huh-7-Basis) wurde für die Transfektion von in vitro transkribierten genomischen HCV-RNAs. Zellfreie Kulturüberstände, Protein-Lysate und total RNA wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Ernte Transfektion HCV Wachstum zu beurteilen. HCV-Genom-Replikation Status wurde durch quantitative RT-PCR und Visualisierung der Gegenwart von HCV-RNA-Doppelstrang ausgewertet. Die HCV-Proteinexpression wurde durch Western-Blot und Immunfluoreszenz unter Verwendung von für HCV-NS3-und NS5A-Proteine Antikörper verifiziert. HCV-RNA-transfizierten Zellen freigesetzt infektiöse Partikel in Kulturüberstand und der Virustiter wurde bestimmt. Luciferase-Assays wurden verwendet, um die Replikationsebene und Infektiosität von HCV-Reporter beurteilen. Zusammenfassend stellen wir verschiedene virologische Tests zur Charakterisierung von verschiedenen Stufen des HCV-Replikationszyklus.
Introduction
Hepatitis-C-Virus (HCV) verursacht Leberzirrhose und Leberkrebs. Es betrifft 170 Millionen Menschen weltweit mit 350.000 Menschen sterben jährlich 1-3. HCV ist ein positiver Strang-RNA-Virus mit einer Genomgröße von 9,6 kb. Das HCV-Genom als ein einzelnes Polyprotein von ca. 3000 Aminosäuren, das proteolytisch durch verschiedene zelluläre und virale Proteasen gespalten, in 10-Polypeptide translatiert wird. HCV-Virus ist der Prototyp der Gattung Hepacivirus und gehört zur Familie der Flaviviridae 4. Bei der Belichtung stellt chronischer HCV-Infektion in 80% der Individuen. Die Infektion ist meist asymptomatisch und rechtzeitige Diagnose kann die therapeutische Intervention zu Leber Verschlechterung verhindern können. Die derzeitige Behandlung nicht optimal sein und kein Impfstoff verfügbar ist 5,6.
Die Ätiologie der Hepatitis C wurde erstmals 1989 7 beschrieben. Studieren HCV-Replikation ist wichtig für die Hepatitis-C-Impfstoff-und Behandlungsforschung, aber es warlang durch das Fehlen eines effizienten Viruskultursystem behindert. Ein molekularer Klon des HCV Infektions wurde gezeigt, bei Schimpansen auf intra-Impfung 8 sein. Anschließend wurden HCV subgenomische Replikon beschrieben, die das virale Genom-Replikation Stufe in einem Zellkultursystem erlaubt 9,10 sezieren. Entdeckung einer Genotyp HCV 2a isolieren JFH-1 (Japanese Fulminante Hepatitis-1), infizieren Zellkultur eröffnet neue Wege für die HCV-Replikation Forschungs 11-13. Genotyp 2a Stamm JFH-1-Basis inter-und intra-und genotypische chimären Viren vom Genotyp 1 HCV Infektions basierend Kultursysteme sind auch 14 bis 18 erhältlich.
Wir haben erfolgreich JFH-1-Stamm-und HCV-intragenotype 2a chimären Virus verwendet, um die hochauflösenden funktionellen Profilierung Karte von Proteindomänen und cis-aktiven RNA-Elemente 19,20 zu erhalten. Demnach beschreiben wir eine effektive Kultursystem routinemäßig verwendet, die ermöglichtStudium der verschiedenen Stadien des HCV-Replikationszyklus und Wirt-Pathogen-Interaktion. Wir präsentieren virologische Untersuchungen auf virale Genom-Replikation und de novo Infektiosität von HCV intragenotype 2a und einem Renilla-Luciferase Reporter basierend HCV beurteilen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Darstellung beschreibt ein Verfahren zum Analysieren des Hepatitis-C-Virus-Replikationszyklus. HCV ist ein humanes Pathogen und die vorgeschriebene Biosafety-Protokoll müssen strikt eingehalten werden. Infektiöse HCV-Zellkultursysteme wurden zuvor 11-13,16,17 beschrieben. Es gibt nur wenige wichtige Punkte zu implementieren, wenn wir nach dem Protokoll dargestellt. Erstens, von hoher Bedeutung ist es, gute Qualität von intakten voller Länge viralen genomischen RNA für nachgeschaltete Studien. Die E…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank F. Chisari for providing Huh-7.5.1 cell line. We would like to thank Justine Ho for editing the manuscript. This work was supported by Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award and National Center for Advancing Translational Sciences, Grant UL1TR000124 to V.A.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Non essential amino acid | Fisher Scientific | MT25025CI | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red | Life Technologies | 11058-021 | |
| Huh-7.5.1 | The Scripps Research Institute | The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center | |
| Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null) | Cedars-Sinai Medical Center | The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides. | |
| XbaI | New England Biolabs Inc. | R0145S | |
| Mung Bean Nuclease | New England Biolabs Inc. | M0250S | |
| T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Electroporation Cuvette (4 mm) | Bioexpress | E-5010-4 | |
| Gene Pulser Xcell Total System | Bio-Rad | 165-2660 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11008 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| PVDF membrane package | Bio-Rad | 162-0263 | |
| Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk | Bio-Rad | 170-6404XTU | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531XTU | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2] | Abcam | ab65407 | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23] | Abcam | ab13830 | |
| Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-035-003 | |
| Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents | GE Healthcare Life Sciences | RPN2236 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| ViiA 7 real-time PCR system | Life Technologies | NA | |
| Renilla Luciferase Assay System kit | Promega | E2810 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| GloMax-Multi Detection System (Luminometer) | Promega |
References
- Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C. Hepatology.. 26(3 Suppl 1), (1997).
- Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).
- Lavanchy, D. The global burden of hepatitis C. Liver Int. 29 (Suppl 1), 74-81 (2009).
- Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. . Flaviviridae: viruses and their replication in Fields Virology. , 1101-1152 (2007).
- Ciesek, S., Manns, M. P. Hepatitis in 2010: the dawn of a new era in HCV therapy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (2), 69-71 (2011).
- Ghany, M. G., et al. An update on treatment of genotype 1 chronic hepatitis C virus infection: 2011 practice guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 54 (4), 1433-1444 (2011).
- Choo, Q. L., et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 244 (4902), 359-362 (1989).
- Kolykhalov, A. A., et al. Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA. Science. 277 (5325), 570-574 (1997).
- Lohmann, V., et al. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science. 285 (5424), 110-113 (1999).
- Blight, K. J., Kolykhalov, A. A., Rice, C. M. Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture. Science. 290 (5498), 1972-1974 (2000).
- Lindenbach, B. D., et al. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science. 309 (5734), 623-626 (2005).
- Wakita, T., et al. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat Med. 11 (7), 791-796 (2005).
- Zhong, J., et al. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (26), 9294-9299 (2005).
- Yi, M., et al. Compensatory mutations in E1, p7, NS2, and NS3 enhance yields of cell culture-infectious intergenotypic chimeric hepatitis C virus. J Virol. 81 (2), 629-638 (2007).
- Pietschmann, T., et al. Construction and characterization of infectious intragenotypic and intergenotypic hepatitis C virus chimeras. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7408-7413 (2006).
- Li, Y., et al. Highly efficient full-length hepatitis C virus genotype 1 (strain TN) infectious culture system. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19757-19762 (2012).
- Yi, M., Lemon, S. Genotype 1a HCV (H77S) infection system. Methods Mol Biol. 510, 337-346 (2009).
- Gottwein, J. M., et al. Development and application of hepatitis C reporter viruses with genotype 1 to 7 core-nonstructural protein 2 (NS2) expressing fluorescent proteins or luciferase in modified JFH1 NS5A. J Virol. 85 (17), 8913-8928 (2011).
- Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathog. 4 (10), (2008).
- Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
- Salloum, S., et al. Rab18 binds to hepatitis C virus NS5A and promotes interaction between sites of viral replication and lipid droplets. PLoS Pathog. 9 (8), (2013).
- Gonzalez, G., et al. Selection of an optimal RNA transfection reagent and comparison to electroporation for the delivery of viral RNA. J Virol Methods. 145 (1), 14-21 (2007).
- Phan, T., et al. Hepatitis C virus NS2 protein contributes to virus particle assembly via opposing epistatic interactions with the E1-E2 glycoprotein and NS3-NS4A enzyme complexes. J Virol. 83 (17), 8379-8395 (2009).
- Schaller, T., et al. Analysis of hepatitis C virus superinfection exclusion by using novel fluorochrome gene-tagged viral genomes. J Virol. 81 (9), 4591-4603 (2007).
- Li, R., et al. Production of hepatitis C virus lacking the envelope-encoding genes for single-cycle infection by providing homologous envelope proteins or vesicular stomatitis virus glycoproteins in trans. J Virol. 85 (5), 2138-2147 (2011).
- Jones, C. T., et al. Hepatitis C virus p7 and NS2 proteins are essential for production of infectious virus. J Virol. 81 (16), 8374-8383 (2007).
- Steinmann, E., et al. Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly and release of infectious virions. PLoS Pathog. (7), (2007).
