Een protocol voor het analyseren van hepatitis C virus replicatie
Summary
Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.
Abstract
Hepatitis C virus (HCV) treft 3% van de wereldbevolking en veroorzaakt ernstige leverkwalen waaronder chronische hepatitis, cirrose en leverkanker. HCV is een omhuld RNA-virus van de familie Flaviviridae. Voor deze behandeling niet volledig effectief en veroorzaakt bijwerkingen. Er is geen HCV-vaccin. Aldus is verdere inspanningen vereist voor een vaccin te ontwikkelen en betere therapie. Een HCV celcultuur systeem is essentieel voor het bestuderen van verschillende groeistadia HCV waaronder virale binnenkomst, genoom replicatie, verpakking en uitgang. In de huidige werkwijze voorgesteld, gebruikten we een wildtype intragenotype 2a chimeer virus, FNX-HCV, en een recombinant FNX-Rluc virus met een Renilla luciferase reportergen de virusreplicatie te bestuderen. Een menselijke hepatoomcellijn (Huh-7 gebaseerde) werd gebruikt voor transfectie in vitro getranscribeerde RNA HCV genoom. Celvrije kweeksupernatanten, eiwit lysaten en total RNA werden geoogst op verschillende tijdstippen na transfectie groei HCV beoordelen. HCV-genoom replicatie status werd geëvalueerd door kwantitatieve RT-PCR en visualiseren van de aanwezigheid van HCV dubbelstrengs RNA. De HCV-eiwitexpressie werd bevestigd door Western blot en immunofluorescentie assays met antilichamen specifiek voor HCV NS3 en NS5A eiwitten. HCV RNA getransfecteerde cellen vrijgegeven infectieuze deeltjes in de cultuur supernatant en de virale titer werd gemeten. Luciferasebepalingen werden gebruikt om de replicatie niveau en de besmettelijkheid van reporter HCV beoordelen. Samenvattend stellen wij diverse virologische assays voor het karakteriseren van verschillende stadia van de HCV replicatie cyclus.
Introduction
Hepatitis C virus (HCV) veroorzaakt cirrose en leverkanker. Het treft 170 miljoen mensen wereldwijd met 350.000 mensen sterven jaarlijks 1-3. HCV is een positieve streng RNA-virus met een genoom grootte van 9,6 kb. Het HCV-genoom wordt vertaald als een polyproteïne van ~ 3000 aminozuurresten die proteolytisch wordt gesplitst door verschillende cellulaire en virale proteasen in 10 polypeptiden. HCV is het prototype virus in het geslacht Hepacivirus en behoort tot de familie Flaviviridae 4. Bij blootstelling HCV vestigt een chronische infectie bij 80% van de individuen. De infectie is meestal asymptomatisch en tijdige diagnose kan therapeutische interventie aan de lever achteruitgang te voorkomen toe te staan. Huidige behandeling niet optimaal en er geen vaccin beschikbaar is 5,6.
De etiologie van hepatitis C werd eerst beschreven in 1989 7. Bestuderen HCV replicatie is belangrijk voor hepatitis C vaccin en behandelingsonderzoek, maar het waslang gehinderd door het ontbreken van een efficiënt viraal kweeksysteem. Een moleculaire kloon van HCV werd aangetoond besmettelijk bij chimpansees op intrahepatische inoculatie 8 zijn. Vervolgens werden sub-genomische HCV replicons beschreven, waardoor het virale genoom replicatie stadium ontleden in een celkweeksysteem 9,10. Ontdekking van een genotype 2a HCV isoleren JFH-1 (Japanse Fulminante hepatitis-1), kunnen infecteren celkweek nieuwe wegen geopend voor HCV replicatie onderzoek 11-13. Genotype 2a stam JFH-1 gebaseerde inter-en intra-genotypische chimere virussen en genotype 1 HCV gebaseerd besmettelijke cultuur systemen zijn ook beschikbaar 14-18.
We hebben met succes gebruik JFH-1 stam en HCV intragenotype 2a chimere virus aan de hoge-resolutie functionele profilering kaart van eiwit domeinen en cis-werkende RNA elementen 19,20 te verkrijgen. Volgens deze hier beschrijven we een effectieve systeem routinematig gebruikt waarmeebestuderen van verschillende stadia van de HCV replicatiecyclus en gastheer-pathogeen interactie. We presenteren virologische assays virale genoom replicatie en de novo infectiviteit van intragenotype 2a HCV en Renilla luciferase reportergen HCV beoordelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze illustratie beschrijft een werkwijze voor het analyseren van het hepatitis C virus replicatie cyclus. HCV is een menselijk pathogeen en het voorgeschreven protocol inzake bioveiligheid moeten strikt worden opgevolgd. Besmettelijke HCV celkweek systemen zijn eerder 11-13,16,17 beschreven. Er zijn enkele cruciale punten die we bij het volgen van de geïllustreerde protocol te implementeren. Ten eerste is het van groot belang om een goede kwaliteit van intacte volledige lengte viraal genomisch RNA voo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank F. Chisari for providing Huh-7.5.1 cell line. We would like to thank Justine Ho for editing the manuscript. This work was supported by Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award and National Center for Advancing Translational Sciences, Grant UL1TR000124 to V.A.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Non essential amino acid | Fisher Scientific | MT25025CI | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red | Life Technologies | 11058-021 | |
| Huh-7.5.1 | The Scripps Research Institute | The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center | |
| Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null) | Cedars-Sinai Medical Center | The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides. | |
| XbaI | New England Biolabs Inc. | R0145S | |
| Mung Bean Nuclease | New England Biolabs Inc. | M0250S | |
| T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Electroporation Cuvette (4 mm) | Bioexpress | E-5010-4 | |
| Gene Pulser Xcell Total System | Bio-Rad | 165-2660 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11008 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| PVDF membrane package | Bio-Rad | 162-0263 | |
| Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk | Bio-Rad | 170-6404XTU | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531XTU | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2] | Abcam | ab65407 | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23] | Abcam | ab13830 | |
| Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-035-003 | |
| Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents | GE Healthcare Life Sciences | RPN2236 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| ViiA 7 real-time PCR system | Life Technologies | NA | |
| Renilla Luciferase Assay System kit | Promega | E2810 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| GloMax-Multi Detection System (Luminometer) | Promega |
References
- Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C. Hepatology.. 26(3 Suppl 1), (1997).
- Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).
- Lavanchy, D. The global burden of hepatitis C. Liver Int. 29 (Suppl 1), 74-81 (2009).
- Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. . Flaviviridae: viruses and their replication in Fields Virology. , 1101-1152 (2007).
- Ciesek, S., Manns, M. P. Hepatitis in 2010: the dawn of a new era in HCV therapy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (2), 69-71 (2011).
- Ghany, M. G., et al. An update on treatment of genotype 1 chronic hepatitis C virus infection: 2011 practice guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 54 (4), 1433-1444 (2011).
- Choo, Q. L., et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 244 (4902), 359-362 (1989).
- Kolykhalov, A. A., et al. Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA. Science. 277 (5325), 570-574 (1997).
- Lohmann, V., et al. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science. 285 (5424), 110-113 (1999).
- Blight, K. J., Kolykhalov, A. A., Rice, C. M. Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture. Science. 290 (5498), 1972-1974 (2000).
- Lindenbach, B. D., et al. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science. 309 (5734), 623-626 (2005).
- Wakita, T., et al. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat Med. 11 (7), 791-796 (2005).
- Zhong, J., et al. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (26), 9294-9299 (2005).
- Yi, M., et al. Compensatory mutations in E1, p7, NS2, and NS3 enhance yields of cell culture-infectious intergenotypic chimeric hepatitis C virus. J Virol. 81 (2), 629-638 (2007).
- Pietschmann, T., et al. Construction and characterization of infectious intragenotypic and intergenotypic hepatitis C virus chimeras. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7408-7413 (2006).
- Li, Y., et al. Highly efficient full-length hepatitis C virus genotype 1 (strain TN) infectious culture system. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19757-19762 (2012).
- Yi, M., Lemon, S. Genotype 1a HCV (H77S) infection system. Methods Mol Biol. 510, 337-346 (2009).
- Gottwein, J. M., et al. Development and application of hepatitis C reporter viruses with genotype 1 to 7 core-nonstructural protein 2 (NS2) expressing fluorescent proteins or luciferase in modified JFH1 NS5A. J Virol. 85 (17), 8913-8928 (2011).
- Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathog. 4 (10), (2008).
- Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
- Salloum, S., et al. Rab18 binds to hepatitis C virus NS5A and promotes interaction between sites of viral replication and lipid droplets. PLoS Pathog. 9 (8), (2013).
- Gonzalez, G., et al. Selection of an optimal RNA transfection reagent and comparison to electroporation for the delivery of viral RNA. J Virol Methods. 145 (1), 14-21 (2007).
- Phan, T., et al. Hepatitis C virus NS2 protein contributes to virus particle assembly via opposing epistatic interactions with the E1-E2 glycoprotein and NS3-NS4A enzyme complexes. J Virol. 83 (17), 8379-8395 (2009).
- Schaller, T., et al. Analysis of hepatitis C virus superinfection exclusion by using novel fluorochrome gene-tagged viral genomes. J Virol. 81 (9), 4591-4603 (2007).
- Li, R., et al. Production of hepatitis C virus lacking the envelope-encoding genes for single-cycle infection by providing homologous envelope proteins or vesicular stomatitis virus glycoproteins in trans. J Virol. 85 (5), 2138-2147 (2011).
- Jones, C. T., et al. Hepatitis C virus p7 and NS2 proteins are essential for production of infectious virus. J Virol. 81 (16), 8374-8383 (2007).
- Steinmann, E., et al. Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly and release of infectious virions. PLoS Pathog. (7), (2007).
