Summary

Ein Protokoll für die Analyse von Hepatitis-C-Virus-Replikation

Published: June 26, 2014
doi:

Summary

Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.

Abstract

Hepatitis-C-Virus (HCV) betrifft 3% der Weltbevölkerung und verursacht schwere Lebererkrankungen wie chronische Hepatitis, Leberzirrhose und Leberzellkarzinom. HCV ist ein umhülltes RNA-Virus aus der Familie Flaviviridae. Strombehandlung nicht wirksam ist und bewirkt, dass nachteilige Nebenwirkungen. Es gibt keine HCV-Impfstoff zur Verfügung. So wird fortgesetzt Aufwand für die Entwicklung eines Impfstoffes und eine bessere Therapie erforderlich. Einem HCV-Zellkultursystems ist kritisch für das Studium verschiedener Stadien der HCV Wachstum einschließlich Viruseintritt, Genom-Replikation, Verpackung und Austritt. In der vorgestellten aktuellen Prozedur verwendeten wir eine Wildtyp-intragenotype 2a chimären Virus, FNX-HCV, und ein rekombinantes FNX-Rluc Virus, eine Renilla-Luciferase-Reportergens um die Virusreplikation zu studieren. Eine menschliche Hepatom-Zelllinie (Huh-7-Basis) wurde für die Transfektion von in vitro transkribierten genomischen HCV-RNAs. Zellfreie Kulturüberstände, Protein-Lysate und total RNA wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Ernte Transfektion HCV Wachstum zu beurteilen. HCV-Genom-Replikation Status wurde durch quantitative RT-PCR und Visualisierung der Gegenwart von HCV-RNA-Doppelstrang ausgewertet. Die HCV-Proteinexpression wurde durch Western-Blot und Immunfluoreszenz unter Verwendung von für HCV-NS3-und NS5A-Proteine ​​Antikörper verifiziert. HCV-RNA-transfizierten Zellen freigesetzt infektiöse Partikel in Kulturüberstand und der Virustiter wurde bestimmt. Luciferase-Assays wurden verwendet, um die Replikationsebene und Infektiosität von HCV-Reporter beurteilen. Zusammenfassend stellen wir verschiedene virologische Tests zur Charakterisierung von verschiedenen Stufen des HCV-Replikationszyklus.

Introduction

Hepatitis-C-Virus (HCV) verursacht Leberzirrhose und Leberkrebs. Es betrifft 170 Millionen Menschen weltweit mit 350.000 Menschen sterben jährlich 1-3. HCV ist ein positiver Strang-RNA-Virus mit einer Genomgröße von 9,6 kb. Das HCV-Genom als ein einzelnes Polyprotein von ca. 3000 Aminosäuren, das proteolytisch durch verschiedene zelluläre und virale Proteasen gespalten, in 10-Polypeptide translatiert wird. HCV-Virus ist der Prototyp der Gattung Hepacivirus und gehört zur Familie der Flaviviridae 4. Bei der Belichtung stellt chronischer HCV-Infektion in 80% der Individuen. Die Infektion ist meist asymptomatisch und rechtzeitige Diagnose kann die therapeutische Intervention zu Leber Verschlechterung verhindern können. Die derzeitige Behandlung nicht optimal sein und kein Impfstoff verfügbar ist 5,6.

Die Ätiologie der Hepatitis C wurde erstmals 1989 7 beschrieben. Studieren HCV-Replikation ist wichtig für die Hepatitis-C-Impfstoff-und Behandlungsforschung, aber es warlang durch das Fehlen eines effizienten Viruskultursystem behindert. Ein molekularer Klon des HCV Infektions wurde gezeigt, bei Schimpansen auf intra-Impfung 8 sein. Anschließend wurden HCV subgenomische Replikon beschrieben, die das virale Genom-Replikation Stufe in einem Zellkultursystem erlaubt 9,10 sezieren. Entdeckung einer Genotyp HCV 2a isolieren JFH-1 (Japanese Fulminante Hepatitis-1), infizieren Zellkultur eröffnet neue Wege für die HCV-Replikation Forschungs 11-13. Genotyp 2a Stamm JFH-1-Basis inter-und intra-und genotypische chimären Viren vom Genotyp 1 HCV Infektions basierend Kultursysteme sind auch 14 bis 18 erhältlich.

Wir haben erfolgreich JFH-1-Stamm-und HCV-intragenotype 2a chimären Virus verwendet, um die hochauflösenden funktionellen Profilierung Karte von Proteindomänen und cis-aktiven RNA-Elemente 19,20 zu erhalten. Demnach beschreiben wir eine effektive Kultursystem routinemäßig verwendet, die ermöglichtStudium der verschiedenen Stadien des HCV-Replikationszyklus und Wirt-Pathogen-Interaktion. Wir präsentieren virologische Untersuchungen auf virale Genom-Replikation und de novo Infektiosität von HCV intragenotype 2a und einem Renilla-Luciferase Reporter basierend HCV beurteilen.

Protocol

Ein allgemeiner Überblick über das Protokoll ist in Fig. 1 dargestellt. 1. Cells Vorbereitung vollständige Wachstumsmedium, das 10-15% fötalem Rinderserum (FBS), 10 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 10 mM Hepes, Penicillin (100 Einheiten / ml), Streptomycin (100 mg / ml) und 2 mM L-Glutamin enthält. Pflegen Huh-7.5.1-Zellen in 13 komplette Wachstumsmedium, das die oben genannten Ergänzungen für in-vitro-Analyse von Hepatitis-…

Representative Results

Hepatitis C-Virus ist ein RNA-Virus ist. Somit zur genetischen Manipulation Zweck hat die genomische HCV-cDNA in einen bakteriellen Plasmid-Vektor kloniert. Ein T7-RNA-Polymerase-Promotorsequenz wurde unmittelbar vor dem 5'-Ende des HCV-Genoms eingeführt. Eine allgemeine Übersicht der HCV-Analyse-Workflow ist in Abbildung 1 dargestellt. Um genomische HCV-RNA mit präziser 3-Ende erzeugen, wird das HCV-Genom-Plasmid, das mit XbaI Restriktionsenzym und die erzeugte Einzelstrangüberhang wur…

Discussion

Diese Darstellung beschreibt ein Verfahren zum Analysieren des Hepatitis-C-Virus-Replikationszyklus. HCV ist ein humanes Pathogen und die vorgeschriebene Biosafety-Protokoll müssen strikt eingehalten werden. Infektiöse HCV-Zellkultursysteme wurden zuvor 11-13,16,17 beschrieben. Es gibt nur wenige wichtige Punkte zu implementieren, wenn wir nach dem Protokoll dargestellt. Erstens, von hoher Bedeutung ist es, gute Qualität von intakten voller Länge viralen genomischen RNA für nachgeschaltete Studien. Die E…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank F. Chisari for providing Huh-7.5.1 cell line. We would like to thank Justine Ho for editing the manuscript. This work was supported by Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award and National Center for Advancing Translational Sciences, Grant UL1TR000124 to V.A.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Fisher Scientific 10-017-CV
Non essential amino acid Fisher Scientific MT25025CI
HEPES Life Technologies 15630080
Glutamax Life Technologies 35050061
Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red Life Technologies 11058-021
Huh-7.5.1 The Scripps Research Institute The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center
Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null)  Cedars-Sinai Medical Center The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides. 
XbaI New England Biolabs Inc. R0145S
Mung Bean Nuclease New England Biolabs Inc. M0250S
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System Promega P1320
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Nanodrop 2000 Thermo Scientific Nanodrop 2000
Electroporation Cuvette (4 mm) Bioexpress E-5010-4
Gene Pulser Xcell Total System Bio-Rad 165-2660
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2  English & Scientific Consulting Kft. 10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 Life Technologies A11008
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 Life Technologies A11020
PVDF membrane package Bio-Rad 162-0263
Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk Bio-Rad 170-6404XTU
Tween-20 Bio-Rad 170-6531XTU
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2] Abcam ab65407
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23] Abcam ab13830
Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP)  Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. 115-035-003
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents  GE Healthcare Life Sciences RPN2236
SUPERSCRIPT III RT  Life Technologies 18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX Life Technologies 11744500
ViiA 7 real-time PCR system Life Technologies NA
Renilla Luciferase Assay System kit Promega E2810
RNase-Free DNase Promega M6101
GloMax-Multi Detection System (Luminometer) Promega

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Citer Cet Article
Ren, S., Contreras, D., Arumugaswami, V. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (88), e51362, doi:10.3791/51362 (2014).

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