Polarisering-baserede total intern refleksion fluorescensmikroskopi (pTIRFM) muliggør real-time detektering af cellemembran dynamik. Denne artikel beskriver implementeringen af pTIRFM for studiet af membranen remodellering under reguleret exocytose. Teknikken er generaliseres til andre processer i cellebiologi, der direkte eller indirekte involverer ændringer i membran form.
For at få nye indsigter i dynamikken i exocytose, vores gruppe har fokus på ændringerne i lipiddobbeltlaget form, der skal præcist reguleres under sammensmeltning af vesikel og plasma membraner. Disse hurtige og lokale ændringer opnås ved dynamiske interaktioner mellem lipider og specialiserede proteiner, der styrer membran krumning. Fraværet af sådanne interaktioner ikke blot ville få ødelæggende konsekvenser for vesikelfusion, men et væld af andre cellulære funktioner, der involverer kontrol af membran form. I de senere år har identiteten af en række proteiner med membran-forme egenskaber blevet bestemt. Hvad er der mangler, er en køreplan for, hvornår, hvor og hvordan de fungerer som fusion og indhold release fremskridt.
Vores forståelse af de molekylære begivenheder, der sætter membran remodeling har historisk set været begrænset af mangel på analysemetoder, der er følsomme over for membran krumning eller har den tidsmæssige opløsning til Track hurtige ændringer. PTIRFM opfylder begge disse kriterier. Vi diskuterer, hvordan pTIRFM er implementeret for at visualisere og fortolke hurtige, submicron ændringer i retningen af chromaffin cellemembraner i tæt kerne vesikel (DCV) fusion. De kromaffinceller vi bruger er isoleret fra kvæg binyrerne. Membranen er farves med en lipofil carbocyanine farvestof, 1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorbenzensulfonat, eller gjorde. DiD intercalates i membranen plan med en "fast" orientering og er derfor følsom over for polarisationen af flygtige felt. DID-farvede cellemembranen er sekventielt begejstret med retvinklede polariseringer af en 561 nm laser (p-pol, s-pol). En 488 nm laser bruges til at visualisere vesikel bestanddele og tidspunkt tidspunktet for fusion. Eksocytose udløst af lokalt perfusion celler med et depolariserende KCl-opløsning. Analyse udføres offline med custom-skrevet software til at forstå, hvordan gjordeemissionsintensiteten ændringer vedrører fusion pore dilatation.
Den korrekte udførelse af exocytose kræver ekstreme ændringer i membrandobbeltlag form til præcist orkestreret. Forud for fusion, lokal bøjning af plasmamembranen under granulatet sker, delvis for at nedbringe den energi barriere for interaktion med dobbeltlag. Senere, da membraner fusionere, områder med høj krumning genereres og skal stabiliseres. Endelig skal sammensmeltede membraner bøjes ud af deres oprindelige form for at udvide fusion pore og muliggøre indhold release 1. Fordi membraner alene er usandsynligt at gennemgå sådanne dramatiske og koordinerede ændringer er nødvendige for at mægle begivenheder proteiner. Men hvordan de virker til at påvirke ændringer i membran topologi under fusionsprocessen er fortsat meget et åbent spørgsmål.
Fremragende in vitro modeller eksisterer for at visualisere membran krumning. Brugen af negativ-pletten EM, for eksempel, har været vigtigt for udformningen af de nuværende molekylære modeller for handlinger foretaget af to p større handelroteins – synaptotagmin og dynamin (til anmeldelser, se Chapman 2 og Henshaw 3). De fleste real-time analyser af exocytose ikke registrerer krumning direkte. I stedet er krumning udledes analyser, der rapporterer om kinetikken for lumenal last release 4-8 eller ændringer i membranareal 9-11. PTIRFM bygger bro mellem in vivo og in vitro-undersøgelser ved at give direkte, real-time målinger af ændringer i membran micromorphology.
PTIRFM, i en nonimaging tilstand, blev udviklet af Axelrod og kolleger til at måle orienteringen af NPD-PE inkorporeres i en model membran 12. Teknikken blev derefter anvendt til at visualisere dynamiske ændringer i levende celler mærket med dil og FM1-43 13-18. I pTIRFM er to flygtige felt polariseringer anvendes til sekventielt at excitere en membran-embedded probe: p-polarisation (i indfaldsplan) og s-polarisering (vinkelret på planet af forekomst). Forud for billeddannelse proben – i dette tilfælde gjorde – kortvarigt sættes til det ekstracellulære medium og får lov til at indskyde i plasmamembranerne i de celler, der skal undersøges. I områder, hvor membranen er parallel med den dækglas (som i en membran flæse eller indrykning), har vil også være ikke-parallelle. Derfor vil disse regioner være exciteres af p-pol stråle. Den p-pol stråle vil mindre effektivt ophidse gjorde i membran regioner, der er for det meste parallelle med dækglas. Pixel-til-pixel forholdet billeder (P / S) rapportering om udledning fra sekventiel p-og s-pol excitation af DID vil derfor specifikt fremhæve områder af membran deformation. I teorien P / S forhold billeder er følsomme over for selv små vinkler af plasmamembranen afvigelse fra dækglas med amplituden af de ændringer, som forudsiges af computersimuleringer 18. P / S billeder er også uafhængig af fluorofor afstand fra dækglas overflade og lokal fluorophorkoncentration. Lokal fluoroforen koncentration i stedet leveres af billeder rapportering om pixel-til-pixel summen af P-emission og 2 gange S emission (P +2 S). P +2 S målingen er følsom over for den præcise geometri indrykning, med nogle, lille eller ingen ændring muligt. Dette kan vises ved computersimuleringer som model overgange i en fusion pore fra en tidlig (dvs. med en smal hals) til en senere tilstand 16,18. P 2 S for et fusioneret vesikel knyttet til plasmamembranen via en smal hals (og med mere gjorde tæt på grænsefladen) forudsiges at være større for eksempel end en fusioneret vesikel med en meget bredere pore (hvor gjorde, er inden for den svageste del af flygtige felt).
I denne artikel vil vi diskutere, hvordan pTIRFM implementeres og udnyttes til at studere de hurtige, lokaliserede ændringer i membran facon, der opstår under fusion pore dilatation. Mens kun én ansøgning er udtrykkeligt discussed er fremgangsmåderne generaliseres til en række andre celle biologiske processer, der direkte eller indirekte involverer membran remodeling.
Polarisering-baserede TIRFM registrerer hurtige, submikroskopisk ændringer i membran topologi. Gennemførelse af teknikken er forholdsvis ligetil, især hvis TIRF optik er allerede på plads. Alt hvad der behøves er et kvartbølgeplade to polariserende terninger, og skodder til at adskille p-pol-og s-pol belysning stier. Den nøjagtige position af disse komponenter på bordet er normalt dikteret af plads.
For at få membran topologiske oplysninger bør den fluorescerende probe anvendte interkalere med en fast eller kendt orientering. Den teknik, som beskrevet i denne artikel, forudsætter brugen af carbocyanine farvestoffer men andre farvestoffer, såsom FM1-43 14, kan også anvendes. Membranen farvning selve proceduren er ligetil. Dyrkede celler kræver kun en meget kort eksponering (mindre end 10 sek) til en lille mængde dil / gjorde for at opnå overstrømmende mærkning af membranen. Tilføjelse overskydende farvestof fører til lysspredning AGGREGates på glas, som mindsker billedkvaliteten. Over-inkubere celler med farvestof fører til farvning internalisering, som har skadelige virkninger på billedkvalitet og muligvis celleviabilitet. Hvis en celle er plettet godt, vil der være klar sondring i P-og S-emission billeder. Som vist i figur 2A, vil P emission levende fremhæve områder af membranen, der er dækglas skrå (dvs. kanterne af cellen fodspor) mens S emissionsintensitet vil være nogenlunde ensartet over cellen fodaftryk. Hvis en klar sondring mellem P og S er ikke synlige, så er det muligt, at cellen dårligt er klæbet til underlaget eller cellemembranen er ikke sundt, og cellen ikke anvendes til forsøg.
Vores tidligere undersøgelser beskriver pTIRFM udnyttet dil som fluorescerende membran probe. Her udnytter vi gjorde, fordi det er velegnet til dual-farve imaging eksperimenter, der beskæftiger GFP / pHluorin som den anden fluorofor. Vi ophidse gjorde with en 561 nm laser end 640 nm laser (som er tættere på excitation peak), fordi fluoroforen blegemidler hurtigere ved 640 nm. Trods det faktum, at 561 nm laser er på halen DID offentliggjorte ekscitationsspektret, fluorescens effektivt udsendes. En anden fordel ved 561 nm laser er, at det ophidser både dil og gjorde muligt for os at bruge den samme polarisering setup for begge sonder. Bemærk, at orienteringen af fluoroforen i membranen vil påvirke fortolkning af membranen topologi. For eksempel, hvis en fluorofor var orienteret med sin overgang dipoler vinkelret på membranen plan (snarere end parallelt eller næsten parallelt, som det er tilfældet med dil eller gjorde), så plane membran regioner vil være lettere fremhævet af S i stedet for P emission.
Vi har også beskrevet teknikker til isolering og elektroporation af bovine adrenal kromaffinceller. Den bovine chromaffin celle er en fremragende secretory model. Det har fordelene ved at være let at vedligeholde i kultur, der reagerer på en række af sekretoriske og besidder store sekretoriske vesikler, som er let visualiseres med konventionel lysmikroskopi. At udtrykke fluorescerende proteiner, celler elektroporeres i suspension før plating på kollagen-behandlede kultur retter. Det er vores erfaring, udtryk effektivitet er langt større med elektroporation end med enten Ca 2 +-fosfat eller Lipofectamine reagenser. Ulempen ved elektroporation er, at det kræver flere celler (så mange ikke overlever processen) og dyre kommercielle reagenser. Af årsager, der er uklart for os, ikke hver membran inkorporerer gjorde. Desuden er kun en brøkdel af cellerne på skålen transficeret. Finde celler, der er transficeret OG farves godt med DID kan være tidskrævende, hvorfor optimere betingelserne for farvning og elektroporation er indsatsen værd.
Sammenfattende er dette enArtikel beskriver, hvordan pTIRFM gennemføres for at overvåge de hurtige og lokaliserede membran deformationer, der opstår under sammensmeltning af tætte kerne vesikler i bovine kromaffinceller. Selv om kun én ansøgning diskuteres, er teknikken velegnet til studiet af andre biologiske processer, der involverer ændringer i membran form, herunder endocytose, cytokinese og celle motilitet.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning er støttet af et nationalt Scientist Development Grant (13SDG14420049) til AA fra American Heart Association og startfonde fra Wayne State University. Vi står i gæld til Dr. Ronald W. Holz og Dr. Mary Bittner for at yde rådgivning vedrørende den bovine binyre præparater og Dr. Daniel Axelrod for assistance med pTIRFM opsætning og nyttige kommentarer til manuskriptet. Syt-1 pHluorin blev anvendt med tilladelse af Dr. Gero Miesenbock (University of Oxford). GCAMP5G blev opnået gennem Addgene. Vi takker James T. Taylor, Tejeshwar Rao, Rachel L. Aikman, og Praneeth Katrapti med hjælp til at optimere forskellige trin i de beskrevne måder.
iXon3 EMMCD Camera | Andor | 897 | |
IX81 Inverted Microscope | Olympus | Side-mounted Filtercube Assembly | |
43 Series Ar-Ion Laser | CVI Milles Griot Laser Optics | 543-AP-A01 | Tunable to 488nm |
Sapphire 561 LP Diode Laser | Coherent | 561nm | |
Scanning Galvo Mirror System | Thorlabs | GVS102 | |
VC3 Channel Focal Perfusion System | ALA Scientific Instruments | ALA VC3X4PP | |
QMM Quartz MicroManifold | ALA Scientific Instruments | ALA QMM-4 | |
10 PSI Pressure Regulator | ALA Scientific Instruments | ALA PR10 | |
Manipulator | Burleigh | TS 5000-150 | |
Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate | Thorlabs | AQWP05M-600 | |
420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube | Thorlabs | PBS201 | |
Six Station Neutral Density Wheel | Thorlabs | FW1AND | |
Stepper-motor Driven SmartShutter | Sutter Instruments | IQ25-1219 | |
HQ412lp Dichroic Filter | Chroma | NC255583 | Joins 488nm and 561nm beams |
Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 100mm VIS 0 | Diverges 488nm beam |
Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 250mm VIS 0 | Diverges 561nm beam |
Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 125mm VIS 0 | Focuses both beams |
Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 50mm VIS 0 | Cemented to filter cube assembly |
z488/561rpc Dichroic | Chroma | z488/561rpc | Filtercube dichroic |
z488/561_TIRF Emission Filter | Chroma | z488/561m_TIRF | Filtercube emission |
UIS2 60x Objective | Olympus | UPLSAPO 60XO | NA 1.37 |
Neon Transfection System | Invitrogen | MPK 5000 | |
MetaMorph Imaging Software | Molecular Devices | ||
DiI Membrane Dye | Invitrogen | V-22885 | For Alignment Purposes |
TH Liberase | Roche | 5401135001 | |
TL Liberse | Roche | 5401020001 | |
DNAse I Type IV from bovine | Sigma | D5025 | |
Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
DiD Membrane Dye | Invitrogen | D-7757 | |
Rhodamine | Invitrogen | R634 | |
.22 μm Membrane Syringe Filter Unit | Millipore | SLGS033SS | |
Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres | Polysciences | 19507 | 0.5 microns |
Immersion Oil | Sigma | 56822 | |
LabVIEW | National Instruments | Controlls galvo mirrors | |
Spinner Flask | Bellco | 1965-00250 |