Polarisering-baserte Total Internal Reflection fluorescens mikroskopi (pTIRFM) muliggjør sanntidsdeteksjon av dynamikk cellemembranen. Denne artikkelen beskriver gjennomføringen av pTIRFM for studiet av membran ombygging under regulert eksocytose. Teknikken er generalizable til andre prosesser i cellebiologi som direkte eller indirekte involverer endringer i membranen form.
For å få ny innsikt i dynamikken i eksocytose, fokuserer vår gruppe på endringene i lipidbilag form som må være nøyaktig regulert under fusjon av vesikkel og plasmamembraner. Disse raske og lokaliserte forandringer oppnås ved dynamiske interaksjoner mellom lipider og spesialiserte proteiner som styrer membranen krumning. Fraværet av slike interaksjoner ville ikke bare ha ødeleggende konsekvenser for vesikkelfusjon, men en rekke andre cellulære funksjoner som innebærer kontroll av membran form. I de senere årene, har identiteten til en rekke proteiner med membran forme egenskaper er bestemt. Det som gjenstår mangler er et veikart om når, hvor og hvordan de fungerer som fusion og innhold utgivelsen fremgang.
Vår forståelse av de molekylære hendelser som gjør at membran ombygging har historisk sett vært begrenset av mangel på analytiske metoder som er følsomme for membran kurvatur eller har tidsmessig oppløsning til Track raske endringer. PTIRFM oppfyller begge disse kriteriene. Vi diskuterer hvordan pTIRFM er implementert for å visualisere og tolke raske, submikron endringer i innretningen av chromaffin cellemembraner under tett kjerne vesikkel (DCV) fusjon. De kromaffinceller vi bruker er isolert fra storfe binyrene. Membranen er farget med en lipofil carbocyanine fargestoff, 1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindodicarbocyanine, 4-klorbenzensulfonat, og gjorde. DID intercalates i membranplanet med en "fast" orientering, og er derfor følsom for polarisering av det flyktige feltet. DID-farget cellemembranen er sekvensielt spent med ortogonal polarisasjon av en 561 nm laser (p-pol, s-pol). A 488 nm laser er brukt for å visualisere vesikkel bestanddeler og tidsøyeblikket fusjon. Exocytose utløses av lokalt perfusjon celler med en depolariserende KCl-løsning. Analysen er utført frakoblet ved hjelp av spesialskrevet programvare for å forstå hvordan gjordeutslippsintensitet endringene er knyttet til fusjon pore dilatasjon.
Riktig utførelse av eksocytose krever ekstreme endringer i membranen bilayer form til å være nettopp orkestrert. Før fusjon, lokal bøyning av plasmamembranen under granule oppstår, blant annet for å redusere energibarrieren for interaksjon av bilayers. Senere, som membraner fusjonere, områder med høy kurvatur genereres og må stabiliseres. Til slutt må smeltet membraner være bøyd ut av sin opprinnelige form til å utvide fusion pore og muliggjøre innhold utgivelsen en. Fordi membraner alene er usannsynlig å gjennomgå slike dramatiske og koordinerte endringer, proteiner er nødvendige for å megle hendelser. Men hvordan de handle for å påvirke endringer i membranen topologi under fusjonsprosessen er fortsatt veldig mye et åpent spørsmål.
Utmerket in vitro modeller eksisterer for å visualisere membran kurvatur. Bruken av negativ-flekken EM, for eksempel, har vært viktig for å forme dagens molekylære modeller for handlingene til to store menneskehandel proteins – synaptotagmin og dynamin (for anmeldelser, se Chapman 2 og Henshaw 3). De fleste sanntidsanalyser av eksocytose ikke oppdage kurvatur direkte. I stedet er kurvatur utledes fra analyser som rapporterer for kinetikken til lumenal last utgivelsen 4-8 eller endringer i membranen området 9-11. PTIRFM bygger bro mellom in vivo og in vitro studier ved å muliggjøre direkte, real-time målinger av endringer i membran micromorphology.
PTIRFM, i en nonimaging modus, ble utviklet av Axelrod og kolleger for å måle orienteringen av OD-PE inkorporert i en modell-membran 12.. Teknikken ble deretter brukt til å visualisere dynamiske endringer i levende celler merket med Dii og FM1-43 13-18. I pTIRFM, er to flyktige felt polarisasjoner anvendt til sekvensielt å eksitere et membran-forankret probe: p-polarisering (i planet av forekomst), og s-polarisasjon (vinkelrett på planet for forekomst). Forut for avbildning, sonden – i dette tilfellet, gjorde – er kort tilsatt til det ekstracellulære medium og tillates å intercalate i plasmamembranen til cellene som skal studeres. I regioner der membranen er nonparallel til dekkglass (som i en membran krusning eller innrykk), det gjorde også vil være nonparallel. Derfor vil slike områder bli opphisset ved p-pol strålen. Den p-pol strålen vil mindre effektivt opphisse gjorde i membran regioner som stort sett parallelt med dekkglass. Pixel-til-pixel ratio bilder (P / S) rapportering om utslipp fra sekvensiell p-og s-pol eksitasjon av DID vil derfor spesielt fremheve områder av membran deformasjon. I teorien, P / S-forhold bilder er følsom overfor selv små vinkler av plasma membran avvik fra dekkglass, med amplituden av de endringer forutses av datasimuleringer 18. P / S-bilder er også uavhengig av fluoroforen avstand fra dekkglass overflate og lokale fluoroforenkonsentrasjon. Lokal fluoroforen konsentrasjon er i stedet gitt av bildene som rapporterer om piksel-til-piksel summen av P-utslipp og 2 ganger S partiklene (P +2 S). P 2 S målingen er følsom for den nøyaktige geometrien i innrykket, med en viss, liten eller ingen endring er mulig. Dette kan bli vist av datasimuleringer som modell overganger av en fusjon pore fra en tidlig (dvs. med en smal hals) til en senere tilstand 16,18. P 2 S av en fusjonert vesikkel festet til plasma membran via en smal hals (og med mer gjorde nær grenseflaten) er anslått til å være større, for eksempel, enn den til en kondensert vesikkel med et mye større porer (hvor DID er innenfor dimmest del av den flyktige felt).
I denne artikkelen diskuterer vi hvordan pTIRFM er implementert og benyttes til å studere de raske, lokaliserte endringer i membranen form som oppstår under fusion pore dilatasjon. Mens bare ett program er eksplisitt discussed, metodene er generaliseres til en rekke andre celle biologiske prosesser som direkte eller indirekte involverer membran ombygging.
Polarisering basert TIRFM oppdager raske, submikroskopiske endringer i membran topologi. Implementering av teknikken er relativt enkelt, særlig hvis TIRF optikk er allerede på plass. Alt som trengs er en kvartbølge plate, to polariserende kuber, og skodder for å skille p-pol og s-pol belysning stier. Den nøyaktige plassering av disse komponentene på bordet er vanligvis diktert av tilgjengelig plass.
For å oppnå membran topologisk informasjon, bør den fluorescerende probe anvendes intercalate med en fast eller kjent retning. Denne teknikk, som er beskrevet i denne artikkelen, forutsetter bruk av carbocyanine fargestoffer, men også andre fargestoffer, slik som FM1-43 14, kan også anvendes. Membranen farging prosedyren i seg selv er grei. Dyrkede celler krever bare en meget kort eksponering (mindre enn 10 sekunder) i en liten mengde av Dii / gjorde for å oppnå strømmende merking av membranen. Legge overflødig fargestoff fører til lysspredning Aggregaterates på glasset som avtar bildekvalitet. Over-rugende celler med fargestoff fører til fargestoff intern som har skadelige effekter på bildekvalitet og muligens celle levedyktighet. Hvis en celle er farget godt, vil det være klart skille i P-og S-utslipps bilder. Som vist i figur 2A, vil P-utslipp levende fremheve områder av membranen som er dekk skrå (dvs. kantene av cellen footprint) mens S emisjonsintensiteten vil være omtrent jevn over hele cellen fotavtrykk. Dersom et klart skille mellom P og S er ikke åpenbar, da er det mulig at cellen er dårlig festet til substratet eller cellemembranen ikke er sunt, og cellen blir ikke brukt for eksperimenter.
Våre tidligere studier som beskriver pTIRFM utnyttet Dii som fluorescerende membran sonde. Her bruker vi gjorde fordi det er egnet for dual-farge bildebehandling eksperimenter som benytter GFP / pHluorin som den andre fluoroforen. Vi opphisse gjorde with en 561 nm laser i stedet for 640 nm laser (som er nærmere dens magnetisering topp), fordi fluoroforen blekemidler mer hurtig ved 640 nm. Til tross for det faktum at 561 nm laser er på halen av DID publiserte magnetisering spektrum, blir fluorescens effektivt avgis. En annen fordel med 561 nm laser er at det interesserer både Dii og gjorde slik at vi kan bruke samme polarisering oppsett for begge sonder. Legg merke til at retningen av fluoroforen i membranen vil påvirke tolkningen av membranen topologi. For eksempel, hvis en fluorofor ble orientert med sin overgangs dipoler vinkelrett på membranplanet (i stedet for parallelt, eller nesten parallelt, slik tilfellet er med Dii eller gjorde), deretter nonplanar membran regioner vil være lettere markert med S i stedet P-utslipp.
Vi har også beskrevet metoder for isolering og elektroporering av bovin adrenal kromaffinceller. Storfe chromaffin celle er en utmerket secretory modell. Den har fordelen av å være lett å vedlikeholde i kultur, som reagerer på en rekke secretogogues, og er i besittelse store sekretoriske vesikler som er lett visualisert med konvensjonell lysmikroskopi. For å uttrykke fluorescerende proteiner, blir cellene elektroporert i suspensjon før plating på kollagen-behandlet kultur retter. I vår erfaring, er uttrykk effektivitet mye høyere med elektroporering enn med enten Ca 2 +-fosfat eller Lipofectamine reagenser. Ulempen med elektroporering er at det krever flere celler (så mange som ikke overlever i prosessen), og kostbare kommersielle reagenser. Av grunner som er uklart for oss, inneholder ikke hver membran gjorde. I tillegg er bare en brøkdel av cellene på fatet transfektert. Finne celler som er transfektert OG er farget godt med gjorde kan være tidkrevende og det er derfor optimalisere forholdene for beising og elektroporering er vel verdt innsatsen.
I sammendrag, er dette enrtikkel beskriver hvordan pTIRFM er implementert for å overvåke de raske og lokaliserte membran deformasjoner som oppstår under fusjon av tette kjerne vesikler i storfe kromaffinceller. Selv om bare en påføring er diskutert, er teknikken ideelt egnet for studier av andre biologiske prosesser som involverer endringer i membranform, inkludert endocytose, cytokinese, og celle motilitet.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen er støttet av en nasjonal Scientist Development Grant (13SDG14420049) til AA fra American Heart Association og oppstart midler fra Wayne State University. Vi står i gjeld til Dr. Ronald W. Holz og Dr. Mary Bittner for å gi råd om de storfe binyrene forberedelser og Dr. Daniel Axelrod for hjelp med pTIRFM oppsett og nyttige kommentarer til manuskriptet. SYT-en pHluorin ble brukt med tillatelse fra Dr. Gero Miesenbock (University of Oxford). GCAMP5G ble innhentet gjennom Addgene. Vi takker James T. Taylor, Tejeshwar Rao, Rachel L. Aikman, og Praneeth Katrapti med hjelp på å optimalisere ulike trinnene i prosedyrene som er beskrevet.
iXon3 EMMCD Camera | Andor | 897 | |
IX81 Inverted Microscope | Olympus | Side-mounted Filtercube Assembly | |
43 Series Ar-Ion Laser | CVI Milles Griot Laser Optics | 543-AP-A01 | Tunable to 488nm |
Sapphire 561 LP Diode Laser | Coherent | 561nm | |
Scanning Galvo Mirror System | Thorlabs | GVS102 | |
VC3 Channel Focal Perfusion System | ALA Scientific Instruments | ALA VC3X4PP | |
QMM Quartz MicroManifold | ALA Scientific Instruments | ALA QMM-4 | |
10 PSI Pressure Regulator | ALA Scientific Instruments | ALA PR10 | |
Manipulator | Burleigh | TS 5000-150 | |
Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate | Thorlabs | AQWP05M-600 | |
420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube | Thorlabs | PBS201 | |
Six Station Neutral Density Wheel | Thorlabs | FW1AND | |
Stepper-motor Driven SmartShutter | Sutter Instruments | IQ25-1219 | |
HQ412lp Dichroic Filter | Chroma | NC255583 | Joins 488nm and 561nm beams |
Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 100mm VIS 0 | Diverges 488nm beam |
Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 250mm VIS 0 | Diverges 561nm beam |
Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 125mm VIS 0 | Focuses both beams |
Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 50mm VIS 0 | Cemented to filter cube assembly |
z488/561rpc Dichroic | Chroma | z488/561rpc | Filtercube dichroic |
z488/561_TIRF Emission Filter | Chroma | z488/561m_TIRF | Filtercube emission |
UIS2 60x Objective | Olympus | UPLSAPO 60XO | NA 1.37 |
Neon Transfection System | Invitrogen | MPK 5000 | |
MetaMorph Imaging Software | Molecular Devices | ||
DiI Membrane Dye | Invitrogen | V-22885 | For Alignment Purposes |
TH Liberase | Roche | 5401135001 | |
TL Liberse | Roche | 5401020001 | |
DNAse I Type IV from bovine | Sigma | D5025 | |
Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
DiD Membrane Dye | Invitrogen | D-7757 | |
Rhodamine | Invitrogen | R634 | |
.22 μm Membrane Syringe Filter Unit | Millipore | SLGS033SS | |
Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres | Polysciences | 19507 | 0.5 microns |
Immersion Oil | Sigma | 56822 | |
LabVIEW | National Instruments | Controlls galvo mirrors | |
Spinner Flask | Bellco | 1965-00250 |