Использование каспазы мультиплексирования Пробирной для определения апоптоза в гипоталамуса Cell Model
Summary
Мультиплекс анализы могут обеспечить полезной информацией для основных клеточных механизмов и ликвидации отходов реагентов и ненужных повторяющихся экспериментов. Мы описываем здесь многозальный каспазы-3/7 анализа активности, используя флуоресцентные и люминесцентные методы, основанные на, чтобы определить жизнеспособность клеток в гипоталамо модели в пробирке следующей окислительного заражения пальмитиновой кислоты.
Abstract
Возможность мультиплексирования анализов при исследовании сложных клеточных механизмов исключает необходимость в повторных экспериментах, обеспечивает внутренний контроль, и уменьшает отходы в затратах и реагентов. Здесь мы опишем оптимизацию многозальный анализа для оценки апоптоза после пальмитиновой кислоты (ПА) вызов в гипоталамо модели в пробирке, используя как флуоресцентные и люминесцентные основе анализов для измерения жизнеспособных количество клеток и каспазы-3/7 деятельность в 96-а Формат микротитрационный планшет. После PA вызов, жизнеспособные клетки определяется резазурин основе флуоресцентного анализа. Каспазы-3/7 активность была затем определена с использованием люминогенных подложку, DevD и нормализованы к числу клеток. Это мультиплексирование анализ является полезным методом для определения изменения в активности каспазы следующее апоптоза стимулом, таким как вызов насыщенной жирной кислоты. Насыщенной жирной кислоты PA может увеличить гипоталамуса окислительного стресса и апоптоза, что указывает на потенциальную ImportaNCE анализов, таких как описаны здесь, что в изучения связи между насыщенных жирных кислот и функции нейронов.
Introduction
Диета, богатая насыщенными жирными кислотами, такими как пальмитиновая кислота (PA) были связаны с ожирением и другими сопутствующими заболеваниями, в том числе сердечно-сосудистых заболеваний и диабета 1, 2. Жирная диета также было показано увеличение окислительного стресса, апоптоз и дегенерации нейронов в гипоталамусе, важным регулятором аппетита и энергии расходов 3-7. Понимание механизма, через который экспозиции высоким содержанием жиров индуцирует гипоталамуса нарушение регуляции Таким образом, важно для развития фармакологических методов лечения ожирения. Тем не менее, клеточные механизмы, через которые диетического жира влияет функции нейронов остаются неясными. Более глубокое понимание того, как жиры, такие как ПА может вызвать начало гипоталамуса апоптоза является необходимым первым шагом на пути к этой цели. Цель этой статьи заключается в описании многозальный анализа для тестирования в пробирке нейронов ответ на воздействие Звуковая, разработанный для использования в исследованиях чypothalamic нейродегенерация. Мы предоставляем подробное описание в пробирке 96-а формате мультиплекса анализа для измерения каспазы 3/7 активность на общее количество клеток в дифференцированного увековечена взрослых мышей гипоталамо клеточной линии (назначенного A12) после окислительного заражения PA 8.
Вкратце, жизнеспособность клеток определяется следующее PA вызов через резазурин основе анализа. Ресазурин является проницаемой соединение клеток, который подвергается ферментативной снижение метаболически активных клеток, процесс полагают, происходит через митохондрии 9. Жизнеспособные клетки непрерывно преобразовывать резазурин в резоруфином, производя флуоресцентный сигнал, пропорциональный количеству жизнеспособных клеток. Каспазы-3/7 активность затем анализировали с использованием DEVD основе lumogenic анализа. DEVD является аминокислотная последовательность (Asp-Glu-Val-Asp) расщепляется каспазы-3. Когда эта последовательность соединен с lumogenic вещества, при активации внутриклеточного каспазы-3/7 и последующим расщеплениемиз DEVD подложки, люминесцентный продукт выпущен. Эта реакция пропорциональна активности каспаз и, таким образом, к индукции апоптоза. Как мертвые клетки не могут производить каспазы, каспазы-3/7 деятельность по своей природе переходного; Поэтому анализ должен быть завершен в период с 30 мин до 4 ч после заражения, в зависимости от эффективности клеточной стресс. Жизнеспособность клеток обратно пропорциональна каспазы-3/7 активностью и могут быть использованы для определения механизмов гибели клеток. Например, этот метод ранее был использован, чтобы показать, что предварительная обработка с пептидного гормона орексина уменьшает апоптоз в клетках гипоталамуса, зараженных перекиси водорода, предполагая, что механизмы страдают от этого лечения играют важную роль в защите против окислительного повреждения 10. Важно отметить, эти анализы клеточной линии и ткани зависит, как они опираются на митохондриальной активности уменьшить реагентов для анализа. Этот протокол был оптимизирован для взрослых мышей гипоталамо (A12) клеток; ОднакоСпособы, описанные может быть изменена, чтобы соответствовать в пределах подобного исследования.
Мультиплексирования анализы от одного культуры и обеспечивает преимущество по сравнению с традиционным методом выполнения отдельных анализов по нескольким причинам. В дополнение к экономии времени, образцы клеток и культуры реагенты, мультиплексирования анализы также могут предоставить знания выживания и гибели клеток, обеспечить внутренний контроль, и устранить необходимость в повторных экспериментах 11, 12.
Альтернативные методы полагались на Вестерн-блоттинга или ИФА, которые надежные анализы, но это дорого и отнимает много времени (1-2 дней), особенно при использовании формата 96-луночного. Без учета времени, необходимого для культуры клеток для мультиплексирования анализа, общее время составляет менее 3 ч. Хотя этот протокол был оптимизирован для использования с A12 клеток, он может быть изменен для использования в других моделях, сохраняя при этом в виду факторы, которые могут повлиять на целостность клеток. Удерживатьдобыча если этот протокол будет работать на серии экспериментов зависит от от количества образцов или экспериментальных условиях и о планируемых последующих экспериментах.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мультиплексный анализ является широко признанным методом, который был использован учеными во многих приложениях, таких как ПЦР, микрочипов иммунологического и других белковых основе методов обнаружения 13, 14. В последнее время мультиплексирования анализы становятся все более и?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа, описанная здесь финансировалась американским Министерством по делам ветеранов биомедицинских лабораторных исследований и развития BX001686-1А1 и В. А. реабилитации исследований и разработок.
Materials
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal bovine serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Dimethy sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8091 | |
| Equipment | |||
| 96W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices |
References
- Akil, L., Ahmad, H. A. Relationships between obesity and cardiovascular diseases in four southern states and Colorado. J. Health Care Poor Underserved. 22, 61-72 (2011).
- Posey, K. A., et al. Hypothalamic proinflammatory lipid accumulation, inflammation, and insulin resistance in rats fed a high-fat diet. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 296, 1003-1012 (2009).
- Moraes, J. C., et al. High-fat diet induces apoptosis of hypothalamic neurons. PloS one. 4, (2009).
- Mayer, C. M., Belsham, D. D. Palmitate attenuates insulin signaling and induces endoplasmic reticulum stress and apoptosis in hypothalamic neurons: rescue of resistance and apoptosis through adenosine 5′ monophosphate-activated protein kinase activation. Endocrinology. 151, 576-585 (2010).
- Benoit, S. C., et al. Palmitic acid mediates hypothalamic insulin resistance by altering PKC-theta subcellular localization in rodents. J. Clin. Invest. 119, 2577-2589 (2009).
- Thaler, J. P., et al. Obesity is associated with hypothalamic injury in rodents and humans. J. Clin. Invest. 122, 153-162 (2012).
- Williams, L. M. Hypothalamic dysfunction in obesity. Proc. Nutr. Soc. 71, 521-533 (2012).
- Belsham, D. D., et al. Generation of a phenotypic array of hypothalamic neuronal cell models to study complex neuroendocrine disorders. Endocrinology. 145, 393-400 (2004).
- Xiao, J., et al. Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay. Appl. Biochem. Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).
- Butterick, T. A., Nixon, J. P., Billington, C. J., Kotz, C. M. Orexin A decreases lipid peroxidation and apoptosis in a novel hypothalamic cell model. Neurosci. Lett. 524, 30-34 (2012).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
- Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening. Curr. Chem. Genomics. 3, 33-41 (2009).
- Steffen, W., Linck, R. W. Multiple immunoblot: a sensitive technique to stain proteins and detect multiple antigens on a single two-dimensional replica. Electrophoresis. 10, 714-718 (1989).
- Gingrich, J. C., Davis, D. R., Nguyen, Q. Multiplex detection and quantitation of proteins on western blots using fluorescent probes. Biotechniques. 29, 636-642 (2000).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
- Smyth, P. G., Berman, S. A. Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system. Biotechniques. 32, 648-650 (2002).
- Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. Caspases: pharmacological manipulation of cell death. J. Clin. Invest. 115, 2665-2672 (2005).
