L'uso di una caspasi Multiplexing test per determinare apoptosi in un modello cellulare ipotalamica
Summary
Saggi Multiplex possono fornire informazioni utile per i meccanismi cellulari di base ed eliminare gli sprechi di reagenti ed esperimenti ripetitivi inutili. Descriviamo qui un multiplex caspasi-3/7 saggio di attività, utilizzando metodi fluorescenti e si basano luminescenti-, per determinare la vitalità cellulare in un modello in vitro ipotalamico seguente sfida ossidativa con acido palmitico.
Abstract
La capacità di multiplexing saggi in studi sui meccanismi cellulari complesse elimina la necessità di esperimenti ripetitivi, fornisce controlli interni, e diminuisce rifiuti nei costi e reagenti. Qui si descrive l'ottimizzazione di un saggio multiplex per valutare l'apoptosi in seguito a un acido palmitico (PA) sfida in un modello ipotalamica in vitro, utilizzando sia fluorescenti e luminescenti saggi basati misurare conteggio delle cellule vitali e caspasi-3/7 attività in un ben 96 formato micropiastra. Seguendo PA sfida, cellule vitali sono stati determinati da un test di fluorescenza basato resazurin-. Caspasi-3/7 attività è stata poi determinata con un substrato luminogenic, DEVD e normalizzato al numero di cellulare. Questo saggio multiplexing è una tecnica utile per determinare cambiamento nell'attività caspasi seguente uno stimolo apoptotico, come sfida acido grasso saturo. L'acido grasso saturo PA può aumentare ipotalamica stress ossidativo e apoptosi, indicando la possibilità ImportaSNO di saggi come quello descritto qui in studio del rapporto tra acidi grassi saturi e funzione neuronale.
Introduction
Le diete ricche di acidi grassi saturi come l'acido palmitico (PA) sono state legate a obesità e altre patologie concomitanti, tra cui le malattie cardiovascolari e il diabete 1, 2. Diete ricche di grassi hanno anche dimostrato di aumentare lo stress ossidativo, apoptosi, e la degenerazione neuronale nell'ipotalamo, un importante regolatore di appetito e il dispendio energetico 3-7. Comprendere il meccanismo attraverso il quale l'esposizione dieta ricca di grassi induce disregolazione ipotalamo è quindi importante per lo sviluppo di trattamenti farmacologici per l'obesità. Tuttavia, i meccanismi cellulari attraverso i quali i grassi alimentari colpisce la funzione neuronale rimangono poco chiari. Una migliore comprensione di come grassi come PA potrebbero innescare insorgenza di vie apoptotiche ipotalamici è necessario un primo passo verso questo obiettivo. L'obiettivo di questo articolo è quello di descrivere un saggio multiplex per la sperimentazione in vitro di risposta neuronale all'esposizione PA, sviluppato per l'uso in studi di hneurodegenerazione ypothalamic. Forniamo una descrizione dettagliata di un formato a 96 pozzetti test multiplex in vitro per la misurazione della caspasi 3/7 attività per numero totale di celle in una linea differenziata immortalato topo adulto ipotalamico cellulare (designato A12) dopo la sfida ossidativo con PA 8.
In breve, la vitalità cellulare è determinata a seguito PA sfida con un saggio resazurina based. Resazurin è un composto permeabile cella subisce una riduzione enzimatica in cellule metabolicamente attive, un processo pensato avvenga tramite mitocondri 9. Cellule vitali continuamente convertono resazurin a resorufina, producendo un segnale fluorescente proporzionale al numero di cellule vitali. L'attività della caspasi-3/7 viene poi analizzata utilizzando un saggio basato lumogenic-DEVD. DEVD è una sequenza amminoacidica (Asp-Glu-Val-Asp) spaccati da caspasi-3. Quando questa sequenza è accoppiato ad una sostanza lumogenic, previa attivazione di intracellulare caspasi-3/7 e successiva scissionedi substrato DEVD, il prodotto luminescente viene rilasciato. Questa reazione è proporzionale all'attività caspasi e quindi l'induzione di apoptosi. Poiché le cellule morte non possono produrre caspasi, caspasi-3/7 attività è per sua natura transitoria; pertanto, l'analisi deve essere completata tra 30 minuti e 4 ore post-sfida, a seconda dell'efficacia delle stressor cellulare. La vitalità cellulare è inversamente proporzionale all'attività caspasi-3/7 e può essere utilizzato per determinare meccanismi della morte cellulare. Ad esempio, questo metodo è già stata utilizzata per dimostrare che il pretrattamento con l'ormone peptidico orexina riduce l'apoptosi in cellule ipotalamiche stimolate con perossido di idrogeno, suggerendo che meccanismi interessate da questo trattamento sono importanti per proteggere dai danni ossidativi 10. È importante notare questi saggi sono linea-e cellule tessuto-dipendente, in quanto si basano su attività mitocondriale per ridurre i reagenti del saggio. Questo protocollo è stato ottimizzato per topo adulto ipotalamico (A12), le cellule; tuttavia,metodi descritti possono essere modificate per adattarsi nell'ambito di ricerche simili.
Multiplexing saggi di un'unica cultura fornisce anche un vantaggio rispetto al metodo tradizionale di eseguire dosaggi individuali per diversi motivi. Oltre al risparmio di tempo, campioni di cellule e reagenti cultura, saggi di multiplazione possono anche fornire conoscenze della sopravvivenza cellulare e morte, fornire controlli interni, ed eliminare la necessità di esperimenti ripetitivi 11, 12.
Metodi alternativi hanno invocato macchie o ELISA occidentali, che sono test affidabili, ma sono costosi e che richiede tempo (1-2 giorni), soprattutto quando si utilizza un formato a 96 pozzetti. Escludendo il tempo necessario per le cellule di coltura per il saggio multiplexing, il tempo totale è meno di 3 ore. Mentre questo protocollo è stato ottimizzato per l'uso con A12 cellule, può essere modificato per l'utilizzo in altri modelli tenendo a mente fattori che possono influenzare l'integrità delle cellule. Scoraggiareestrazione se questo protocollo funzionerebbe per una serie di esperimenti dipende dal numero di campioni o condizioni sperimentali e su esperimenti valle pianificati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il saggio multiplex è una tecnica ben accettato che è stato usato dagli scienziati in numerose applicazioni come PCR, microarrays immunodetezione e altri metodi di rilevamento a base di proteine 13, 14. Recentemente, saggi multiplexing sono diventati sempre più utilizzato in vitro esperimenti basati piatto-in e sono stati convalidati come un metodo accurato per valutare la citotossicità e la vitalità 12. Nel protocollo di cui sopra, abbiamo dimostrato l'efficacia di…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro qui descritto è stato finanziato dal US Department of Veterans Affairs Laboratorio Biomedico di Ricerca e Sviluppo BX001686-1A1 e VA Riabilitazione Ricerca e Sviluppo.
Materials
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal bovine serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Dimethy sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8091 | |
| Equipment | |||
| 96W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices |
References
- Akil, L., Ahmad, H. A. Relationships between obesity and cardiovascular diseases in four southern states and Colorado. J. Health Care Poor Underserved. 22, 61-72 (2011).
- Posey, K. A., et al. Hypothalamic proinflammatory lipid accumulation, inflammation, and insulin resistance in rats fed a high-fat diet. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 296, 1003-1012 (2009).
- Moraes, J. C., et al. High-fat diet induces apoptosis of hypothalamic neurons. PloS one. 4, (2009).
- Mayer, C. M., Belsham, D. D. Palmitate attenuates insulin signaling and induces endoplasmic reticulum stress and apoptosis in hypothalamic neurons: rescue of resistance and apoptosis through adenosine 5′ monophosphate-activated protein kinase activation. Endocrinology. 151, 576-585 (2010).
- Benoit, S. C., et al. Palmitic acid mediates hypothalamic insulin resistance by altering PKC-theta subcellular localization in rodents. J. Clin. Invest. 119, 2577-2589 (2009).
- Thaler, J. P., et al. Obesity is associated with hypothalamic injury in rodents and humans. J. Clin. Invest. 122, 153-162 (2012).
- Williams, L. M. Hypothalamic dysfunction in obesity. Proc. Nutr. Soc. 71, 521-533 (2012).
- Belsham, D. D., et al. Generation of a phenotypic array of hypothalamic neuronal cell models to study complex neuroendocrine disorders. Endocrinology. 145, 393-400 (2004).
- Xiao, J., et al. Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay. Appl. Biochem. Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).
- Butterick, T. A., Nixon, J. P., Billington, C. J., Kotz, C. M. Orexin A decreases lipid peroxidation and apoptosis in a novel hypothalamic cell model. Neurosci. Lett. 524, 30-34 (2012).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
- Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening. Curr. Chem. Genomics. 3, 33-41 (2009).
- Steffen, W., Linck, R. W. Multiple immunoblot: a sensitive technique to stain proteins and detect multiple antigens on a single two-dimensional replica. Electrophoresis. 10, 714-718 (1989).
- Gingrich, J. C., Davis, D. R., Nguyen, Q. Multiplex detection and quantitation of proteins on western blots using fluorescent probes. Biotechniques. 29, 636-642 (2000).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
- Smyth, P. G., Berman, S. A. Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system. Biotechniques. 32, 648-650 (2002).
- Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. Caspases: pharmacological manipulation of cell death. J. Clin. Invest. 115, 2665-2672 (2005).
