无细胞的转录和翻译的机械囊泡的封装建设模拟蜂窝

1。准备DNA模板从一个标准的实验室菌株大肠杆菌中纯化质粒大肠杆菌 ，如大肠杆菌大肠杆菌 DH5a中或新商业套件蓝。可替换地，直链的PCR产物，可以类似地用市售的试剂盒纯化。洗脱DNA与H 2 O只。 苯酚-氯仿提取的DNA溶液26。 确定DNA浓度和纯度， 例如，通过紫外线吸光率或其他合适的方法。高效转录翻译，重要的是要使用高纯度的DNA。 2。准备薄的脂质膜称量干脂质粉末溶解在溶剂中。对于1 -棕榈酰-2 -油酰-SN-甘油-3 -磷酸胆碱（POPC），储备溶液的制备在氯仿中，在浓度为40毫克/毫升。 注：有机溶剂必须始终处理的玻璃吸管和瓶子。换句话说，决不能使用塑料。商店s滴答的解决方案中的气密性，抗溶剂的琥珀色玻璃瓶在-20℃下，优选在氩气下。 等分试样12微摩尔到5毫升的圆底烧瓶中加入220微升40毫克/毫升原液（POPC）。 减压蒸除溶剂，用旋转蒸发器（ 图1），以产生薄的脂质膜。 牢固地连接的圆底烧瓶中，蒸馏管，有一个圆形的剪辑，并开始在烧瓶的旋转。 启动的循环水通过冷凝器盘管。使用的热浴中，是没有必要的，因为氯仿61.2°C在正常大气压下具有低的沸点。 确保检查活塞打开，该系统是开放的气氛。打开真空泵慢慢地关闭活栓到系统应用真空。 的薄的脂质膜沉积在圆底烧瓶中的壁形成一个不透明的膜在旋转蒸发这是肉眼可见的。让旋转蒸发持续0.5-2小时。要停止的过程中，慢慢释放真空压力，停止了转动，取下圆底烧瓶中。 3。脂质再悬浮和囊泡同质化薄的脂质膜，直接在圆底烧瓶中加入1毫升18.2MΩH 2 O。溶液剧烈振荡以最大的速度，约每分钟3200转，从玻璃上分离，用肉眼可观察到脂质膜。 脂质分散转移到2毫升离心管中。 建立了一个环站举行匀浆5毫米的小费。将下面的均质牢牢固定脂质分散离心立场。冲洗的均化分散体浸渍18.2MΩH 2 O中的前端和运行几秒钟。 将分散体直接将脂质分散体，以确保次的尖端处的微量离心管的底部不接触。均质功率4级或14000转1分钟。 4。囊泡挤压和冻干的组装部件的小型挤出机（ 图2），它由一个外壳和容纳两个聚四氟乙烯内部膜支持，两个O形环，和一个特富龙轴承的保持器螺母。 将两个O形圈进入膜内部支持的凹槽。预湿两个过滤器和一个400nm的膜。该过滤器将被放置对聚四氟乙烯O型圈的内侧，与它们之间的膜。 将膜放置在支持到挤出机中的外壳与膜包围的两个过滤器之间的O形环。将特富龙轴承外壳内，并附加固定螺母并用手拧紧。 冲洗两个注射器，并填补一个18.2MΩ水的。将注射器针头插入到小的holes聚四氟乙烯的挤出机组件的任一端上。针应该很容易滑动，不要强行针。固定注射器进入挤出机挤出住房和紧固。 通过挤出机出来的水缓慢地推入一个注射器和成其他的通水。这代表一个通道。重复一共有三个通道，确保不存在任何泄漏。取下注射器水和处置的水。 与样品填充一个注射器，连接到挤出机中，并如上所述在步骤4.3中，通过膜囊泡溶液缓慢通过。重复10倍，总的11通道。由于挤压过程的进行，样品会变得混浊，更容易推动穿过膜。突然减少阻力，但是，通常表示一个破裂的膜。 挤出囊泡溶液转移到微量离心管中，将40μl等分的囊泡。闪光冻结各等份，在任一干冰或液氮。 用离心蒸发器在30℃下过夜冻干各等份存储冻干空的囊泡在-20°C 5。封装转录翻译机械转录 – 翻​​译反应中混合各成分，并加入20个单位的RNA酶抑制剂。在冰上孵育。 添加DNA模板。控制反应，250毫微克质粒编码mVenus的或类似的荧光蛋白后面的T7转录启动子和一个强大的E.大肠杆菌核糖体结合位点的建议。 用无RNA酶的水使终体积为25微升。 水合物冻干囊泡的等分试样（来自步骤4.6）与10μl的反应组装在步骤5.3中。简言之涡的混合物，直至囊泡悬浮。这应小于30秒。 3在冰上孵育反应0分钟，以允许膨胀的小泡。 稀释20倍，至终体积为30μl加入到27.0微升的50mM Tris-盐酸，50 mM氯化钠，pH值7.4和20.2毫克/毫升的蛋白酶K DNA酶和RNA酶1.5微升1.5微升囊泡的囊泡混合物也可以被添加在这一点上，作为一种替代蛋白酶K降解extravesicular材料。 孵育至少2.5小时，在37℃下 6。显微镜检查在不同时间点的囊泡和荧光蛋白的生产进度。囊泡将有较大的直径大于400nm的孔隙的膜用于囊泡挤出的大小。 准备样品室放置一个20×5毫米的硅垫片到一个标准的显微镜幻灯片。吸取10微升囊泡进入样品室。在室放置一个硅化玻璃盖玻片。 观察囊泡与63X油分散Ø类似ŗ的明场和荧光显微镜使用适当的过滤器设置为利用荧光蛋白的目的。