Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme
Summary
Nöral progenitör mitoz nöron kritik bir parametredir. Nöral progenitör mitoz anlayışımızın çok sabit doku analizine dayanmaktadır. Embriyonik beyin dilimleri Canlı görüntüleme, kontrollü bir ortamda, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile mitoz değerlendirmek için çok yönlü bir tekniktir.
Abstract
Kısa süreli de, mitoz beyin de dahil olmak üzere organların gelişimi için temel karmaşık ve dinamik çok adımlı bir işlemdir. Gelişmekte olan serebral korteks, sinir atalarıdır anormal mitoz beyin büyüklüğü ve işlevi bozukluklara neden olabilir. Bu nedenle, nöral progenitör mitoz mekanizmalarını anlamak için araçlar için kritik bir ihtiyaç vardır. Kemirgenlerde kortikal gelişim bu sürecin eğitim için olağanüstü bir modeldir. Nöral progenitör mitoz sık sabit beyin bölümlerinde incelenmiştir. Bu protokol ayrıntılı olarak ex vivo embriyonik beyin dilimleri mitoz canlı görüntüleme için bir yaklaşım anlatacağız. Beyin çıkarma, beyin gömme, beyin dilimleri Vibratome bölümlendirilmeleri, lekelenme ve dilimleri kültürlemenin ve time-lapse görüntüleme: Biz dahil olan bu işlem için kritik adımları anlatacağız. Biz o göstermek ve mitoz alım sonrası analizi gerçekleştirmek için nasıl ayrıntılı olarak anlatacağız. Biz temsili sonuçları fr dahilom hayati boya Syto11, transgenik fareler (histon H2B-EGFP ve merkezleme-EGFP) ve utero elektroporasyon (MCherry α-tubulin) kullanarak bu deneyi. Bu işlem en iyi optimize edilebilir nasıl ve mitoz genetik düzenleme çalışması için modifiye edilebilir nasıl tartışacağız. Beyin dilimleri mitoz Canlı görüntüleme kontrollü bir ortamda yaş, anatomi ve genetik pertürbasyonun etkisini değerlendirmek ve yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile veri büyük miktarda üretmek için esnek bir yaklaşımdır. Dolayısıyla bu protokol nöral progenitör mitoz analizi için mevcut araçları tamamlayacak.
Introduction
Bu protokolün genel amacı embriyonik beyin dilimleri nöral progenitör mitoz canlı görüntüleme gerçekleştirmek için nasıl tarif etmektir. Kültürde beyin dilimleri canlı görüntüleme kullanarak, bu protokol, bir in vivo ortamda yüksek oranda benzer bir ortamda sinir progenitörlerin mitoz yönlerine bir çok yönü tahlil için basit bir yöntem sağlamaktadır. It) utero elektroporasyon ile 1-5 manipüle edilmiş olan mutant hayvan ve / ya da beyin beyinlerine uygulanabilir. Bu teknik sadece kültür ortamına bir madde eklenmesi ile, sinir ön-'mitoz ile ilgili farmakolojik maddelerin etkisini test etmek için de idealdir. Özetle, bu makalede nörogenezi okuyan bir teknik zorlu protokol erişilebilir hale getirecek.
Nöron sırasında, farklı nöral progenitör popülasyonları sonunda 6-8 neokorteks yetişkin altı kortikal katmanları katkıda nöronlar oluşturmak için kesin bölünmeler tabi. Nöroepitel (NE) hücreler, kendini yenileme simetrik bölmek gibi erken kortikal geliştirme, nöral prekürsör havuzu genişler. NE hücreler daha sonra radyal glial hücreler (RGCs) dönüştürmek. Başlangıçta RGCs ancak nöron toplu sırasında, bölünme RGCs 'ana mod asimetrik olup, iki yeni RGCs üretmek için simetrik bölmek. Asimetrik bir bölümü olarak, 1 RGC yeni RGC ve ya bir post-mitotik nöron ya da daha özel bir progenitör (ya da kısa sinir öncü (SNP), bir dış radyal glia (ORG), ya da bir ara progenitör (INP) yol açar 2,3,7,9. INPS, SNP ve Orgs sonra alt ventrikül, ventriküler nöronların üretebilir, ve korteks bazal bölgeleri, sırasıyla. Dolayısıyla, atalarıdır hücre bölünmesi nöronları üretmek için temel bir süreçtir neokorteks.
Çeşitli çalışmalar belirli mitoz RGCs özellikleri ve kızı hücrelerinin kaderi arasında bir korelasyon olduğuna işaret. Haydar et al. Ve Takahashi et al.RGC mitoz süresi ve nöron ilerledikçe hücre döngüsü uzunluğu artışı, bir bulgu çalışmalar 10-13 takip yankılandı olduğunu göstermiştir. Bir dizi çalışma ventriküle mitotik iğ yönlendirme göre, sırasıyla, beyinde üretilen nöronların türleri ve döl konumu, 3,10,14-16 içeren nöron ve kortikogenezin yönlerini etkileyen olduğunu ileri sürmüşlerdir. Yarılma düzlemi yönlendirilmesi, doğrudan hücre kaderini etkiler tartışmalıdır, ama sonuç bu mitoz parametre etkiler nöron kalır. Daha fazla mitoz önemini vurgulayan mitoz mekaniği oynayan çok sayıda gen nöron ve uygun beyin gelişimi için 17-20 çok önemli olduğunu gözlemdir.
Mitoz dinamik bir süreç, henüz bugüne kadar nöral progenitör mitoz ayrıntılı çalışmaların çoğu in vitro hücre kültürü yoluyla sabit doku bölümleri veya nöral atalarıdır görüntüleme analizini kullanmak. Böylece, mitoz değerlendirmek için genel yöntemleri sadece bu sürecin bir anlık sağlamak ve hücreler bir dokuda nasıl davrandığını ortaya çıkarmak için başarısız. Nöral progenitör mitoz Canlı görüntüleme giderek nöral progenitör işlevini anlamak için kritik bir araç haline gelmiştir. Örnekler için bu referanslar bakınız 4,8,10,21-25. Çeşitli seçkin protokoller hazırlanması ve beyin dilimleri 26,27 görüntülenmesi için yayınlanmıştır. Ancak bugüne kadar, görüntüleme ve mitoz analizi için geniş kapsamlı bir protokolü tarif edilmemiştir veya video gösterdi.
Bu teknik, beyin bölümlerinin sabit analizi üzerinde çeşitli önemli avantajlar sunar. Beyin dilimleri Time-lapse analiz esnek bir şekilde analiz edilebilir ölçüde daha fazla veri noktaları nesil sağlar. İlk olarak, veri birkaç dakika veya birkaç saat boyunca ayrı zaman noktalarında toplanmıştır. Bir birey zaman noktaları (statik bir montaj oluşturmak için) ya da analiz edebilirsinizfilm içine farklı zaman noktaları birleştirebilirsiniz. İkincisi, dilim konfokal görüntüleme beyin dilimleri farklı Z bölümlerde veri nesil sağlar. Sonuç olarak, ayrı ayrı bölümler analiz edilebilir. Seçenek olarak ise, tek tek bölümlerin yığınları maksimum yoğunluk çıkıntı halinde birleştirilebilir. Üçüncü olarak, analiz hücreler komşu hücreler ve yapılarına göre bölmek ortaya koyarak, bir doku bağlamında yapılır. Dördüncü olarak, bu ideal mitotik kusurları bazı kanıtlar göstermektedir mutantların analizi için uygundur. Birlikte bu protokol, kendi laboratuarlarında nöral progenitör mitoz canlı görüntüleme yürütmek isteyen araştırmacılara yardımcı olmak için önemli adımlar netleştirmeye yardımcı olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tarif ettiğimiz protokolün önemli bir avantajı sinir atalarıdır mitoz dinamik bir zamansal çözünürlük sağlamasıdır. Tipik olarak, gelişmekte olan beyinde mitoz görselleştirmek için deneyler, sabit bir doku bölümlerinin immünofloresan kullanılarak gerçekleştirilir. Ama bu yaklaşım sadece bir zaman noktasında mitoz bir anlık görüntüsünü sağlar.
Beyin dilimleri mitoz görüntüleme için en kritik olan birkaç adım vardır: 1) beyin dilimleri transferi ve mont…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar NINDS / NIH, R00-NS064197 ve NINDS / NIH, R01NS083897 (DLS hem de) fon kabul.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 100X N2 | Life technologies | 17502048 | for culture medium |
| 50X B27 without vitamin A | Life technologies | 12587010 | for culture medium |
| DMEM/F12 | Life technologies | 11320033 | for culture medium |
| Heat-inactivated horse serum | Sigma Aldrich | H1138-500ml | for culture medium |
| Heat-inactivated calf serum | Sigma Aldrich | F4135-500ML | for culture medium |
| FGF | R&D Sytems | 3139-FB-025 | for culture medium |
| EGF | for culture medium | ||
| 10X HBSS | Life technologies | 14065-056 | for the dissection of the embryos |
| Hepes Free Acid | Sigma Aldrich | H4034 | dilute to 1M (pH7.4) |
| 2.5M D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | for the dissection of the embryos |
| 0.9M NaHC03 | Life technologies | 25080-094 | for the dissection of the embryos |
| low-melting agarose | Fisher | BP165-25 | for generating slices |
| Loctite 404 glue | Loctite 404 | 46551 | keep at 4˚C |
| syto11 | Life technologies | S7573 | Make 5µl aliquots |
| 3 mg/ml collagen type I | Life technologies | A1048301 | for culturing slices |
| glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | for culturing slices |
| petri dishes | for dissection of the embryos | ||
| digital thermometer | to measure the temperature of the agarose | ||
| spatula | to transfer brains | ||
| paintbrush | alternative to transfer brains | ||
| vibratome | Leica | VT1000s | for generating slices |
| dissecting microscope | dissecting out embryos | ||
| imaging microscope | A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber |
References
- Gal, J. S., et al. Molecular and morphological heterogeneity of neural precursors in the mouse neocortical proliferative zones. J Neurosci. 26, 1045-1056 (2006).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. Journal of Neuroscience. 30, 7028-7036 (2010).
- Konno, D., et al. Neuroepithelial progenitors undergo LGN-dependent planar divisions to maintain self-renewability during mammalian neurogenesis. Nat Cell Biol. 10, 93-101 (2008).
- LoTurco, J. J., Manent, J. -. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 Suppl 1, (2009).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Dev Growth Differ. 50, 499-506 (2008).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146, 18-36 (2011).
- Englund, C., et al. and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. Journal of Neuroscience. 25, 247-251 (2005).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409, 714-720 (2001).
- Wang, X., Tsai, J. -. W., Lamonica, B., Kriegstein, A. R. A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex. Nat Neurosci. 14, 555-561 (2011).
- Haydar, T. F., Ang, E., Rakic, P. Mitotic spindle rotation and mode of cell division in the developing telencephalon. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2890-2895 (2003).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
- Pilaz, L. -. J., et al. Forced G1-phase reduction alters mode of division, neuron number, and laminar phenotype in the cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 21924-21929 (2009).
- Calegari, F., Huttner, W. B. An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis. J Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).
- LaMonica, B. E., Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Mitotic spindle orientation predicts outer radial glial cell generation in human neocortex. Nature Communications. 4, 1665 (2013).
- Postiglione, M. P., et al. Mouse Inscuteable Induces Apical-Basal Spindle Orientation to Facilitate Intermediate Progenitor Generation in the Developing Neocortex. Neuron. 72, 269-284 (2011).
- Silver, D. L., et al. The exon junction complex component Magoh controls brain size by regulating neural stem cell division. Nat Neurosci. 13, 551-558 (2010).
- Pulvers, J. N., et al. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline. Proc Natl Acad Sci USA. , 107-16595 (2010).
- Feng, Y., Walsh, C. A. Mitotic spindle regulation by Nde1 controls cerebral cortical size. Neuron. 44, 279-293 (2004).
- Megraw, T. L., Sharkey, J. T., Nowakowski, R. S. Cdk5rap2 exposes the centrosomal root of microcephaly syndromes. Trends Cell Biol. 21, 1-11 (2011).
- Bond, J., et al. A centrosomal mechanism involving CDK5RAP2 and CENPJ controls brain size. Nat Genet. 37, 353-355 (2005).
- Shu, T., et al. Doublecortin-like kinase controls neurogenesis by regulating mitotic spindles and M phase progression. Neuron. 49, 25-39 (2006).
- Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. Dynamic Interactions between Intermediate Neurogenic Progenitors and Radial Glia in Embryonic Mouse Neocortex: Potential Role in Dll1-Notch Signaling. Journal of Neuroscience. 33, 9122-9139 (2013).
- Hu, D. J. -. K., et al. Dynein recruitment to nuclear pores activates apical nuclear migration and mitotic entry in brain progenitor cells. Cell. 154, 1300-1313 (2013).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Publishing Group. 7, 136-144 (2004).
- Tyler, W. A., Haydar, T. F. Multiplex Genetic Fate Mapping Reveals a Novel Route of Neocortical Neurogenesis, Which Is Altered in the Ts65Dn Mouse Model of Down Syndrome. Journal of Neuroscience. 33, 5106-5119 (2013).
- Noctor, S. C. Time-Lapse Imaging of Fluorescently Labeled Live Cells in the Embryonic Mammalian Forebrain. CSH Protoc. , (2011).
- Elias, L., Kriegstein, A. R. Organotypic slice culture of E18 rat brains. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
- Shitamukai, A., Konno, D., Matsuzaki, F. Oblique radial glial divisions in the developing mouse neocortex induce self-renewing progenitors outside the germinal zone that resemble primate outer subventricular zone progenitors. Journal of Neuroscience. 31, 3683-3695 (2011).
- Hadjantonakis, A. -. K., Papaioannou, V. E. Dynamic in vivo imaging and cell tracking using a histone fluorescent protein fusion in mice. BMC Biotechnol. 4, 33 (2004).
- Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells. Transgenic Res. 13, 155-164 (2004).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. R. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
- Yang, Y. -. T., Wang, C. -. L., Van Aelst, L. DOCK7 interacts with TACC3 to regulate interkinetic nuclear migration and cortical neurogenesis. Nat Neurosci. 15, (2012).
- Siegenthaler, J. A., et al. Retinoic Acid from the meninges regulates cortical neuron generation. Cell. 139, 597-609 (2009).
- Schenk, J., Wilsch-Bräuninger, M., Calegari, F., Huttner, W. B. Myosin II is required for interkinetic nuclear migration of neural progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 16487-16492 (2009).
