의 효율적인 생산 및 정제 재조합 쥐과 Kindlin-3 생물 물리학 연구 곤충 세포에서
Summary
Kindlins는 인테그린을 통해 세포 부착 해 기본적인 그러나 그들의 연구는 세균의 호스트에서 재조합을 표현에서 발생하는 어려움에 의해 방해되었다. 우리는 여기에서 배큘로 바이러스에 감염된 곤충 세포에서의 효율적인 생산 방법을 설명합니다.
Abstract
Kindlins는 세포 표면 수용체 인테그린 중에서, talin로 필수적 coactivators 있고 외부에서 인테그린 신호 전달에 참여하고, 세포 핵의 유전자 전사의 조절. kindlins은 ~ 75 kDa의 멀티 도메인 단백질과 NPxY 모티브 인테 β-서브 유닛 세포질 꼬리의 상류 T / S 클러스터에 결합한다. hematopoietically 중요한 kindlin 이소, kindlin-3, 혈전 형성시 혈소판 응집을 위해 중요하다, 감염과 염증 및 골 흡수의 파골 세포 족 세포 형성에 대한 응답으로 굴러 백혈구. 이 과정에서 Kindlin-3의 역할은 다양한 세포 및 생리 학적 연구 결과는. 그러나, 추가 연구에 대한 단백질의 고품질 밀리그램 수량을 취득하는 효율적인 방법이 필요하다. 우리는 배큘-D를 사용하여 재조합 뮤린 kindlin-3의 효율적인 발현 및 정제를 위해, 여기에 설명 된 프로토콜을 개발했다그 생물 리 학적 특성화를 허용하도록 고순도 전장 단백질의 충분한 양을 수득 인 Sf9 세포에서 발현 시스템을 떨어져 나간. 같은 접근 방식은 다른 포유 동물 kindlin 이소 형의 연구에 걸릴 수 있었다.
Introduction
kindlin 가족의 단백질은 중요한 초점 접착 어셈블리의 구성 요소 및 복잡한 생활에 필수적이다. 3 포유류의 아형 (kindlin-1, kindlin-2 및 kindlin-3)가있는 Kindlins은, talin 1과 함께 세포 수용체의 인테그린의 coactivators 간주됩니다. 인테 – 매개 세포 접착 높은 진핵 생물의 세포 외 기질 (ECM)에 세포 표면을 연결합니다. 그것은 조직의 무결성, 배 발생, 뼈 대사, 지혈, 면역력을 포함 생리적 현상의 과다에 중요한 일반적인 과정이다. 인테 – 매개 세포 부착은 자신의 보존 NPxY 모티브에서 인테 β-서브 유닛 세포질 꼬리 (CTS)에 talin과 kindlin의 결합을 통해 내부 아웃 신호 전달을 통해 활성화됩니다. kindlin 단백질의 생물 의학 중요성은 지금까지 kindlin-2는 전사에 관여하는 몇 가지 최근의 보고서에서 밝혀졌다 핵, 그러나 확장알은 2,3를 제어 할 수 있습니다.
Kindlins는 F2 하위 도메인의 중심에 pleckstrin 상동 (PH) 도메인에 의해 중단되는 양자 C-말단 FERM (4.1 밴드, ezrin, radixin, moesin) 도메인의 소유에 의해 hallmarked 약 75 kDa의의 멀티 도메인 단백질이다 4,5. kindlin-2와 kindlin-3 PH 도메인의 연구는 지질 두 번째 메신저 포스파티딜 이노시톨 – (3,4,5) – 트리스 포스페이트 및 포스파티딜 이노시톨 – (4,5) – 비스 포스페이트 6-8에 바인딩 것으로 나타났다. 그러나 kindlin -1 PH 도메인의 연구는 바인딩으로부터 지질을 방지 이소 특정 염다리 의해 kindlin-1에서 설명 될 수 훨씬 낮은 친화력으로 PtdIns (3,4,5) P (3)에 결합한다는 것을 보여 9. 또, 전개 될 것으로 예측되지만 세포막 10,11의 내부 전단에 세린에 결합되어 kindlins의 F1 도메인에 삽입 ~ 100 아미노산 루프가있다. kindlin의 FERMtalin의 FERM 도메인 pleckstrin 상동 도메인을 소유하지 않더라도 도메인, talin의 FERM 도메인에 일치하는 것으로 간주됩니다. 두 kindlins 및 talin는 FERM 도메인의 F3 지역을 통해 인테 β-꼬리에 NPxY 모티프와 상호 작용하지만, talin가 막 근위 한 12-16을 대상으로하면서 kindlin은 막 말단 모티브에 바인딩합니다. 또 둘 Kindlins 및 talin 다른 FERM 단백질 11,17에서 발견되지 유비퀴틴 조 방면으로 N-말단 F0 도메인을 갖는다. kindlin-2의 F0 도메인에 대한 연구는 독립적으로 포스파티딜 이노시톨 – (4,5) – 비스 포스페이트 풍부한 막 (17)에 결합하는 것으로 나타났습니다.
kindlins는 paralogue 특정 조직 발현 패턴 및 비 중복 생리 기능을 나타낸다. Kindlin-1은 주로 표피에서 발현되고, 또한 작은 범위로 결장, 위, 신장은; kindlin-2 재하 표현 되나 집중되어 가로 무늬 매끄러운근육 및 배아 발달 4로 표현만을 kindlin이고, kindlin-3 거핵구 18에서 발견 kindlin-3의 높은 농도를 가진 조혈 조직에서 발현된다. 그러나, 최근의 연구는 기능성 단백질이뿐만 아니라 19 내피 조직에서 발현되는 것을 제안했습니다.
Kindlin-3에 의한 혈액의 중요한 생리 학적 역할에 심각한 의료 관심입니다. 그것은 혈소판 응집 및 감염과 염증 (21, 22)과 골 흡수 (23) 파골 세포 족 세포 형성에 대한 응답으로 혈전 형성 (20), 백혈구 압연시 확산을 위해 중요하다. 생명을 위협하는 출혈 장애 및 재발 성 세균성 감염 20,24,25 특징으로하는 질환 – 또한, kindlin-3 인간의 파괴는 접착 결핍 유형-III 백혈구에 이르게한다. 생쥐 Kindlin-3 녹아웃 연구에서 단백질의 중요한 기능을 밝혀세포 접착 KIND3 -. / – 마우스는 kindlin-3가 결여 인간의 증상을 닮은 인해 비활성 혈소판 인테그린, 심각한 골 화석 증, 및 손상 백혈구 접착 (20, 22)에 심한 출혈과 같은 별개의 표현형을 표시합니다.
kindlins에 대한 고해상도 구조 데이터는 날짜, 같은 pleckstrin 동성 kindlin-1 9 kindlin-2 (26, 27)의 (PH) 도메인 및 kindlin-1 11 kindlin의 F0 도메인으로 각각의 하위 도메인으로 제한되어 -2 17. 각 kindlin 폴리펩티드의 하위 도메인의 대부분은 그러나 복제 및 구조 분석 (예이츠와 길버트, 게시되지 않은 관찰) 저항했으며, 전체 길이 단백질의 연구는 E.을 사용하여 충분한 양을 표현하고 정화의 어려움에 의해 방해되었다 대장균 (게시되지 않은 관찰과 Harburger 등. 14). kindlin-3와 푸에 상당한 의료 관심이 있습니다nction, 다른 두 가족과 함께, 최근에 우리는 배큘로 바이러스 감염 (12)에 의해 구동 스포 도프 테라 프 루기 페르 세포에서의 재조합 발현에 의해 밀리그램 수량을 생성합니다. 따라서 우리는 여기에 광범위한 구조 연구, 생화학 적 분석에 적합한 곤충 세포 배양에서 재조합 마우스 kindlin-3 밀리그램 수량의 생산을위한 방법을 설명합니다.
이 프로토콜에서 우리는 설계 녹아웃 백 미드 (: 1629 BAC10 KO)를 사용합니다 즉, 혼자, 가능한 비리 (28)를 생성 할 수 없습니다. 바이러스 성 DNA 따라서이 경우도 kindlin-3 유전자 (FERMT3)과 재조합의 결과로 바이러스 높은 표현하지만 중복 늦게 유전자를 대체하는 FERMT3 유전자의 결과를 포함하는 전송 벡터와 재조합에 의해 구출 바이러스 라이프 사이클 (28)의 일부로서 마우스 kindlin-3을 표현 바이러스. 우리는이 문제를 확인kindlin-3의 제조 방법의 다른 표현 호스트로 표현하고 정화하려는 시도로 인해 우리는 복제에 사용하고 많은 표현에 배포 할 수있는 POPIN 벡터 제품군의 다양성에 (게시되지 않은 관찰) 엄청나게 어려운 증명뿐만 아니라 후 29 개최합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
배큘로 바이러스 발현 시스템은 점점 더 인기를 X-선 결정학을 포함한 생물 물리학 연구를 사용하여 단백질의 특성에 대한 재조합 단백질의 밀리그램 양의 생산을위한 중요한 도구가되고있다. 더 실험적 요구에도 불구 배큘 발현 시스템은 E. 비해 여러 장점을 제공한다 대장균 중 하나는 적절한 보호자 및 번역 후 변형에 대한 기회의 존재 예를 들어, 진핵 세포 유래의 단백질에 대한 네이티브에 가까운 환경입니다. kindlin-3을 표현하는 우리의 노력에서 다른 표현 호스트는 포유 동물 세포 라인과 박테리아 발현 균주 (게시되지 않은 관찰)을 포함 하였다. 일반적으로, 많은 E. 대장균 시험 균주는 재조합 kindlin-3의 매우 적은 양 (;되지 않은 관측 ~ 0.5 ㎎ / 문화 L)를 생산했다. 그러나, 곤충 세포에서 배큘로 바이러스 중심의 표현은 공동으로, 특히 효과적이었다재조합 세포질 단백질 (게시되지 않은 관찰)의 밀리그램을 분리하는 데 필요한 큰 바이오 매스를 생성 할 의무가 더 포유 동물 세포에서 일시적 발현에 mparison. 우리는 존재 진핵 생물의 보호자가 kindlin-3의 효율적인 생산을 허용 할 수 있음을 추측.
baculoviridae는 곤충 세포를 감염 및 재조합 단백질 발현이 작품에 사용되는 배큘로 바이러스는 핵 polyhedrosis 바이러스 (AcNPV) 캘리 포니 오토 그라파에 기초한다. 자연 속에서 오토 그라파 캘리 포니 카 (알팔파 lopper) 곤충의 유충에 감염 AcNPV는 virons는 따라서 그들의 릴리스에 대한 필요한 보호를 제공하는 결정 성 단백질 매트릭스에 캡슐화되어있다 폐색을 형성하는 폴리 헤드린 단백질을 필요로한다. 배양 된 세포에 폐쇄기구의 형성은 복제에 필요하기 때문에 비용 소비하지 않습니다. 외래 단백질을 발현의 경우는 폴리 헤드린 단백질 유전자는 R 수있다관심의 단백질에 대한 유전자 재조합 AcNPV에 eplaced. AcNPV 다른 Lepidopteron 종을 감염시킬 수있는 재조합 단백질 발현 군대 웜 스포 도프 테라 프 루기 페르의 목적을 위해 번데기 난소 세포가 사용됩니다. 그것이 같은 것을 : 필수적인 바이러스 성 유전자, ORF1629가 (KO 1629 BAC10) 노크 아웃 백 미드의 결과 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼의 삽입에 의해 불 활성화 될 수 있도록 여기에 설명 된 방법에서는 AcNPV의 백 미드 (BAC10)가 설계된다 전염성 baculovirions (28)를 형성 할 수 없습니다. KO 1629 및 FERMT3 함유 전송 벡터 수리도 폴리 헤드린 프로모터 (28)의 제어하에 FERMT3 유전자를 포함하고 있습니다 가능한 게놈의 결과로 조옮김을 통해 비활성 ORF1629,, : 선형 BAC10와 인 Sf9 세포의 공동 형질.
우리는 THRE 통해 kindlin-3 고순도의 재조합 마우스의 격리를위한 정화 프로토콜을 설명E 단계 크로마토 그래피 방법. 여기에 사용되는 방법은 쉽게 다른 그의 태깅 된 단백질에 적용될 수있다. 우리는 더 kindlin-3를 정화 이온 교환 단계를 사용하지만 우리는 kindlin-3는 F1 도메인 내에서 폴리 라이신 스트레칭 등의 기본 잔류의 큰 숫자를 가지고 같은이 더 의사 선호도 단계라고 생각합니다. 또한 kindlin-3에 결합하고 함수 원형질막의 세포질 표면과 상호 작용하는 것으로 간주되고, 따라서 우리는 염기성 잔기의 클러스터링이 단백질은 음으로 하전 된 막에 대항 할 수 있다고 예측한다.
정제 프로토콜에 기술 된 버퍼는 표준 간주 자주 구조 생물학에서 사용된다. thermofluor 분석 (그림 5) kindlin-3는 pH가 6.0 이상이 가장 버퍼 조건에서 안정되어 있음을 보여줍니다. β1 : kinldin-3을 연구 할 때 우리의 실험을 알리는에 특히 유용하고 중요염화나트륨 (12)의 낮은 농도로 pH 6.1에서 뛰어난 스펙트럼을 산출 NMR에 의해 꼬리 상호 작용.
모든 생물 물리학 연구에 착수하기 전에, 그것은 관심의 정제 된 단백질이 실제로 제대로 접혀 기능적으로 활성화되고 있음을 입증하는 것이 중요합니다. 이전의 간행물에서 우리는 재조합 kindlin-3 발현 및 크기 – 배제 크로마토 그래피, 동적 광산란, 분석 용 초 원심 분리 및 소각 X 선 산란에 의해 평가 정제 된이 방법을 사용하면, 용액 중의 단량체와 단 분산 것을 입증하고 있었다 또한 이전의 세포 생리 학적 연구 14,20,22와 라인에 기본 단백질, 같은 동작하는지 확인하여, 바인딩 및 막 원심 NPxY 및 β의 1A 세포질 꼬리 (14)의 상류 세린 / 트레오닌 클러스터를 인식 할 수. 열 안정성 분석의 사용을 제안 번째의 추가 방법관심의 단백질의 전자 적절한 폴딩, 같은 잘못 접힌 단백질로 인해 노출 된 소수성 잔기에 높은 형광 배경에 발생합니다.
단백질의 kindlin 제품군은 생체 내에서 인테그린의 필수 coactivators 그들의 예기치 않은 역할이 발견 된 이후 많은 관심의 초점을했습니다. 이 재조합을 표현하고 그 구조를 해결하기 위해 많은 노력이 시작되었습니다. 지금까지 제한된 성공은 전체 길이 재조합 단백질의 밀리그램 수량을 표현에서보고되고있다 그러나 우리는 여기에 구조 연구가 가능하게 수준에서 큰 규모의 표현을 허용하는 배큘로 바이러스 시스템의 사용을 설명합니다. 재조합 kindlin-3의 대량 생성함으로써 우리는이 단백질의 추가 연구를 도움이 될 것으로 기대하고 있습니다. 재조합 쥐 kindlin-3 여기에 설명 된 배큘로 바이러스 구동 방법 및 정화 워크 플로우는 다른 kindlin 이소 형을 표현하고 정화하는 데 사용할 수어느 또한 표현하고 또한 폴리 라이신 펼쳐진을 소유하기 어려운, 또한 이러한 균주에 표현하지 핵산 결합 단백질과 같은 다른 세포질 단백질을 위해 구성 될 수있다.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 문화 인 Sf9 세포 주식의 유지 보수 기술 지원을 Weixan 루 감사합니다. LAY는 의학 연구위원회 (MRC) 대학원 재학에 의해 지원되었다. RJCG는 왕립 학회 대학의 연구원이었다. 구조 생물학의 옥스포드 사업부는 인간 유전학, 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 코어 상 부여 번호 090532/Z/09/Z에 대한 Wellcome 트러스트 센터의 일부입니다.
Materials
| Sf-900 II serum free media (SFM) 1X liquid | Life Technoligies | 10902-096 | store at 4°C and warm to room temperature before use |
| Cellfectin II Reagent | InVitrogen | 10362-100 | Alternatively, GeneJuice transfection (EMD) reagent can be used |
| Streptomycin Sulphate (solid) | Melford | S0148 | Sterilise filter (0.22μm filter) before use |
| Penicillin G, potassium salt (solid) | Melford | P0580 | Sterilise filter (0.22μm filter) before use |
| CELLSTAR Sterile 6-well Culture Plate | Greiner bio-one | 657160 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10100-147 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8849 | Caution: Protease inhibitors are dissolved in DMSO |
| Bovine pancrease deoxyribonuclease (Dnase) I | Sigma | D5025 | |
| HisTrap FF (5ml) | GE Heathcare | 17-5286-01 | Requires an Äkta FPLC machine |
| HiTrap Heparin (5ml) | GE Heathcare | 17-0407-01 | Requires an Äkta FPLC machine |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units (with Ultracel-50 membrane) | Millipore | UFC905024 | 15ml capacity and a MWCO of 50kDa protein concentrator |
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