Определение ледовязающих плоскостей антифризовых белков с помощью флуоресценции на основе аффинити ледовой плоскости

Производство антифризовых белков (AFPs) является важным механизмом выживания некоторых организмов, которые живут в среде, нагруженной льдом. До недавнего времени считалось, что единственной функцией AFPs было предотвращение или замедление роста внутренних кристаллов льда, которые блокировали бы кровообращение, причиняли повреждение тканей и осмотическое напряжение. Организмы, которые не могут терпеть какой-либо степени замерзания, такие как рыба, выражают AFPs полностью препятствовать росту кристалла льда¹. Другие, такие как трава, замерзают толерантно и выражают AFPs для того чтобы ингибировать recrystallization льда который уменьшает образование больших кристаллов льда в их^{тканях 2.} Стабилизация мембран при низкой температуре является еще одной функцией, которая была предложена для AFPs^3. Недавно была предложена новая роль для AFP антарктической бактерии, Marinomonas primoryensis, от покрытых льдом солоноватых^{озер 4}. Это AFP является частью гораздо большего белка адгезин^5, который, как полагают, прикрепить бактерии к льду для лучшего доступа к кислороду и питательным^{веществам 6}. Другие микробы, как известно, выделяет AFPs, которые могут изменить структуру льда, в котором они живут⁷.

AFPs были найдены в некоторых рыб, насекомых, растений, водорослей, бактерий, диатомовых и грибков. Они имеют удивительно различные последовательности и структуры в соответствии с их эволюцией от различных прародителей в различных случаях; и все же все они связываются со льдом и препятствуют его росту механизмом ингибирования адсорбции^8. AFPs каждый из них имеет определенную поверхность, которая выступает в качестве своего ледовязательного участка (IBS). Они, как правило, были определены на сайте направлены мутагенез поверхностных^{остатков 9-11}. Предполагается, что IBS организует молекулы воды в ледопоем узоре, который соответствует конкретным плоскостям льда. Таким образом AFP формирует свой ligand перед связывать к ему^{5, 12}. Ледяные плоскости могут быть определены их индексами Миллера, и различные AFPs могут связываться с различными плоскостями. Таким образом, тип I AFP от зимней камбалы связывается с 20-21 пирамидальных^{плоскостей 13}, тип III AFP связывает как первичную призму и пирамидальные плоскости с помощью соединения ледовязной^{поверхности 11,14}, в то время как ели budworm AFP, гиперактивный AFP, связывается одновременно как с первичными и базальными^{плоскостями 15,16}. Другие гиперактивные AFPs, такие как MpAFP, связываются с несколькими плоскостями льда, о чем свидетельствует их полное покрытие одного полушария^{кристалла льда 5,17}. Предполагается, что способность гиперактивных AFPs связывать базальные плоскости, а также другие плоскости, может объяснить их 10-кратную более высокую активность над умеренно активными AFPs¹⁸. Хотя эффективность гиперактивных AFPs хорошо документирована, их способность связываться с несколькими плоскостами льда до сих пор не понята.

Оригинальный метод определения AFP-связанных ледяных самолетов был разработан Чарльз Найт^13,19. В этом методе макроскопический одиночный кристалл льда устанавливается на полый металлический стержень (холодный палец) и образуется в полушарии, погружая его в полушарие чашку, наполненную дегазацией воды. Затем полушарие погружается в разбавленный раствор AFPs и слой льда выращивается из раствора AFP в полушарии кристалла льда в течение нескольких часов, контролируемых температурой этиленгликола, циркулирующего через холодный палец. Кристалл льда удаляется из раствора, отделяется от холодного пальца и помещается в морозильную камеру от -10 до -15 градусов по Цельсию. Поверхность соскаблит острым лезвием, чтобы удалить замороженную поверхностную пленку раствора белка антифриза, а кристалл льда может сублимироваться не менее 3 часов. После сублимации ледяные плоскости, связанные AFPs, можно рассматривать как белые травленные узоры, полученные из остаточного белка. Ледяное полушарие может быть ориентировано на его c-оси иосей, чтобы найти базальные и призмы плоскостей льда, и определить миллер индексы травления патчи.

Здесь мы описываем модификацию оригинального метода определения AFP-связанных плоскостей льда, метод, который мы называем флуоресценцией на основе сродства ледяной плоскости (FIPA)¹¹. AFPs флуоресцентно помечены либо химерные метки, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP)^11,16,17,20, или с флуоресцентным красителем ковалентно связаны с AFP^5,21. Флуоресцентно помеченные AFPs адсорбированы к одному кристаллу льда и заросли с помощью той же экспериментальной процедуры, что и оригинальные эксперименты по травлению льда. Степень привязки AFP к растущему полушарию льда может контролироваться на протяжении всего эксперимента с помощью ультрафиолетовой (УФ) лампы. После завершения эксперимента полушарие может быть непосредственно снято с холодного пальца и изображено без сублимации. Однако, при желании, полушарие может быть оставлено на сублимировать, чтобы визуализировать традиционный ледяной etch. Изменения, внесенные в методологию FIPA, сокращают традиционный протокол травления льда на несколько часов. Кроме того, существует потенциал для одновременного изображения нескольких AFPs, каждый с другой флуоресцентной этикеткой, чтобы визуализировать перекрывающиеся модели AFP-связанных ледяных плоскостей.