Сортировка<em> Streptomyces</em> Сотовые Пеллеты Использование сложного объекта Параметрический Analyzer и сортировщик
Summary
Жидкие выращенных культур Streptomyces характеризуются мицелиальных гранул, которые неоднородны по размеру. Мы здесь опишем метод для анализа и сортировки такие пеллеты в высокой пропускной образом. Эти гранулы могут быть использованы для дальнейшего анализа, которые обеспечат приводит к понимать и контролировать неоднородность роста.
Abstract
Стрептомицеты являются нитчатые бактерии почвы, которые используются в промышленности для производства ферментов и антибиотиков. При выращивании в биореакторах, эти организмы образуют сети взаимосвязанных гиф, известный как гранулы, которые неоднородны по размеру. Здесь мы опишем метод для анализа и сортировки мицелия гранулы с помощью сложного объекта Параметрический Analyzer и сортировщик (Copas). Подробные инструкции приведены для применения прибора и основного статистического анализа данных. Кроме того, мы опишем, как гранулы могут быть отсортированы по пользовательских настроек, что позволяет дальнейшую обработку, например, при анализе РНК или содержанием белка. С помощью этой методики механизм, лежащий в гетерогенной рост может быть решена. Это будет способствовать улучшения стрептомицетов как клеточной фабрики, учитывая тот факт, что производительность коррелирует с размером гранул.
Introduction
Стрептомицетов являются нитевидные почвенные бактерии, которые хорошо известны за их знания, чтобы сделать антибиотики, а также соединения, которые могут быть использованы в качестве иммунодепрессантов или для борьбы с грибковыми инфекциями или рака 1,2. Кроме того, эти организмы вырабатывают ферменты, которые представляют интерес для широкого спектра промышленных применений 3. Большинство из этих коммерчески интересных соединений производятся в биореакторах. Рост стрептомицетов в биореакторах характеризуется образованием сложных структур взаимосвязанных гиф, известных как комки или гранулы. Эти многоклеточные структуры весьма неоднородны в отношении размера 4 и может достигать размеров, которые более чем в миллион раз больше, чем одноклеточного бактерии, такие как кишечная палочка или Сенная палочка. Хотя неоднородность рассматривается как полезного признака в естественных биологических системах 5, считается, производство ловушка в промышленности. Биореакторные культивации должны быть воспроизводимым и управляемым, чтобы получить максимально возможные урожаи. Детальное понимание роли каждого из типов гранул в биореакторе Поэтому крайне важно, чтобы улучшить стрептомицетов как клеточной фабрики.
Проточная цитометрия обычно используется для анализа отдельных клеток в популяции 6. Flow цитометров может приобрести многопараметрическая информацию одновременно измерения характеристик клеток (например, размер, плотность и флуоресценции многоцветной). Таким образом, свойства клеток могут быть связаны таким образом способствуя нашему пониманию гетерогенности в культуре и существование различных популяциях клеток 6. Более специализированные инструменты позволили сортировать клетки в зависимости от заданных пользователем параметров. Например, мутанты могут быть подвергнуты скринингу. После сортировки, такие мутантные клетки можно культивировать для дальнейшей характеристики. Это уже доказали свою полезность, в частности,для улучшения продуктивности штаммов 7,8. Сопла проточных цитометров обычно позволяют для прохождения клеток с максимальным диаметром около 10 мкм. Таким образом, гранулы из стрептомицетов не могут быть проанализированы с регулярными цитометров. Они, однако, могут быть проанализированы с сложного объекта параметрического Analyzer и сортировщик (Copas). Подобно обычным цитометров, Copas может приобрести многопараметрических данных частиц в высокой пропускной образом. В зависимости от типа Copas размера частиц 10-1,500 мкм могут быть проанализированы. Кроме того, это позволяет для сортировки отдельных частиц, которые можно использовать для выращивания или после анализов, таких как выделения ДНК, РНК или белков. Copas был первоначально разработан для анализа и сортировки мелких многоклеточных организмов, таких как нематоды Caenorhabditis Элеганс 9, и эмбрионов и личинок Drosophila 10. Инструменты были также использованы для данио 11 Aй для нитчатых грибов 12,13. Последние организмы также образуют мицелия гранулы, которые даже больше, чем те, которые образованы на нитчатых бактерий. Недавно мы показали, что использование Copas также возможно для стрептомицетов 4. Мы здесь описывают экспериментальные порядок использования Copas оценить гранул неоднородность в Streptomyces coelicolor, в том числе подробную информацию о методологии для сортировки гранул в зависимости от размера. Пожалуйста, обратите внимание, однако, что этот способ также может быть использован для анализа других гранул, образующих стрептомицетов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Проточная цитометрия позволила высокоскоростной анализ большого числа отдельных клеток, что способствовало более глубокому пониманию гетерогенности в клоновых популяциях 6. Обычный цитометрии потока не представляется возможным для анализа многоклеточных мицелиальных гранул стрептомицетов и грибов. Наша работа показала, что с высокой пропускной анализ Streptomyces гранул является возможным использованием Copas. Процедура, описанная здесь просто, быстро и надежно воспроизводимое. Критическим параметром иметь в виду, во время работы прибора является скорость потока, которая не должна превышать 100 событий / сек (шаг 3,8 этого протокола). Если концентрация гранул, и, следовательно, скорость потока, становится слишком высокой, значения TOF будет просчет, потому что прибор не может определить отдельные гранулы. Достаточно разбавления пробы добавлением PBS преодолевает эту проблему.
Недостатки
Использование Copas Плюс д здесь имеет диаметр сопла 1 мм, который подходит для измерения частиц с размером в диапазоне от 30-700 мкм. Это сопло поэтому позволяет измерения гранул, образованных стрептомицетов. В случае мицелиальных грибов микро-колонии может быть больше, что ограничивает общую применимость Copas Plus. Copas XL может измерять частицы до 1500 мкм по размеру, но его чувствительность в нижней части диапазона диаметром меньше по сравнению с из Copas Plus. И Copas Плюс и Copas XL не может анализировать частиц менее 30 мкм. Это означает, что отдельные микробные споры или клетки не могут быть проанализированы. Кроме того, Copas не может точно анализировать небольшие агрегаты спор и клеток или очень малых микро-колоний. Для этого, регулярные анализаторы клеток следует использовать. Это ограничение преодолевается Biosorter Юнион Biometrica, который может анализировать частицы в диапазоне 1-1,500 мкм. Приз покупку однако гораздо выше.
Copas является надежным инструментом, который прост в эксплуатации. Тем не менее, иногда гранулы не обнаружено после загрузки образца в кювету для образца и началом измерения. Причиной, как правило, забиты запись трубка, которая может быть легко решена, нажав команду "чистый". Это заставит гранулы обратно из системы труб в чашку для образца. Альтернативный причиной может быть то, что крышка не должным образом размещен на кювету для образца. Это приводит к потере давления и сопутствующего необнаружения гранул.
Значение и будущие направления
Мы здесь сосредоточены на анализе размера гранул но установка Copas также способен анализировать и сортировать на основе флуоресценции и плотности. Обнаружение флуоресценции позволяет анализировать экспрессию генов на основе журналистами, таких как GFP. Кроме того, композиция клеток может быть оценена. Еще более мощным является возможность отделить гранулы согласно Эти показателиОслабляет. Сортировка гранулы могут быть использованы для последующих анализов, в том числе все-омик исследований. В самом деле, мы уже отсортированы 60000 больших и 200000 маленьких гранул, и показали, что протеом значительно отличается между большими и малыми гранул 4. Таким образом, эта технология обеспечивает новый, ведет к улучшению стрептомицетов как сотовые заводов.
Основное преимущество технологии Copas время. Предыдущие исследования на клеточных гранул проводили с использованием микроскопа, и это ограничивает количество гранул, которые могут быть проанализированы до нескольких сотен 16. Микроскопические исследования уже предположил существование двух популяций гранул в жидких выращенных Streptomyces культур 16. Действительно, две популяции гранул были обнаружены независимо от условий культивирования в большом количестве различных актиномицетов 4. Этот размер неоднородность не ограничивается нитевидных стрептомицетов, но наблюдалось также в нитчатых грибов 12 </ SUP>. Во всех случаях, основные механизмы неоднородности пока не известны. Возможность сортировать пеллеты в зависимости от размера и флуоресценции позволяет разгадать такие механизмы.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Copas PLUS | Union Biometrica | PLUS | Large particle flow cytometer including lasers and software |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | PBS component |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541 | PBS component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S3264 | PBS component |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P9791 | PBS component |
| Difco Yeast Extract | BD Biosciences | 210933 | Media component |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | Media component |
| Oxoid Malt Extract | Fisher Scientific | OXLP0039B | Media component |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | Media component |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | Media component |
| MgCl2.6H2O | Sigma Aldrich | M2670 | Media components. Add after autoclaving. |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | F8775 | Fixation of pellets |
| Sodium Hypochlorite Solution | Sigma Aldrich | 71696 | For cleaning of the instrument |
| EtOH | VWR | 20816.367 | For cleaning of the instrument |
| Erlenmeyer Flask (250 ml) | Fisher Scientific | 214-1132 | Culture flask for growing Streptomyces |
| Springs | Verenfabriek De Spiraal | Custom-Made | Used in culture flask. RVS1.4401/Length 210 mm/Diameter 17 mm/Pitch 5 mm |
| Sterile Centrifuge Tube (15 ml) | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Syringes (50 ml) | Sigma | Z683698 |
References
- Hopwood, D. A. . Streptomyces in nature and medicine: the antibiotic makers. , (2007).
- van Wezel, G. P., McDowall, K. J. The regulation of the secondary metabolism of Streptomyces: new links and experimental advances. Nat. Prod. Rep. 28, 1311-1333 (2011).
- Anné, J., Maldonado, B., Van Impe, J., Van Mellaert, L., Bernaerts, K. Recombinant protein production and streptomycetes. J. Biotechnol. 158, 159-167 (2012).
- van Veluw, G. J., et al. Analysis of two distinct mycelial populations in liquid-grown Streptomyces cultures using a flow cytometry-based proteomics approach. Appl. Microbiol. Biotechnol. 96, 1301-1312 (2012).
- Veening, J. W., Smits, W. K., Bistability Kuipers, O. P. epigenetics, and bet-hedging in bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).
- Davey, H. M., Winson, M. K. Using flow cytometry to quantify microbial heterogeneity. Curr. Issues Mol. Biol. 5, 9-15 (2003).
- Betz, J. W., Aretz, W., Härtel, W. Use of flow cytometry in industrial microbiology for strain improvement programs. Cytometry. 5, 145-150 (1984).
- Bell, P. J., et al. A flow cytometric method for rapid selection of novel industrial yeast hybrids. Appl. Environ. Microbiol. 64, 1669-1672 (1998).
- Pulak, R., Strange, K. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. C. elegans: methods and applications. , 275-286 (2006).
- Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Génétique. 175, 1505-1531 (2007).
- Carvalho, R., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, (2011).
- de Bekker, C., van Veluw, G. J., Vinck, A., Wiebenga, L. A., Wösten, H. A. B. Heterogeneity of Aspergillus niger microcolonies in liquid shaken cultures. Appl. Environ. Microbiol. 77, 1263-1267 (2011).
- van Veluw, G. J., et al. Heterogeneity in liquid shaken cultures of Aspergillus niger inoculated with melanised conidia or conidia of pigmented mutants. Stud. Mycol. 74, 47-57 (2013).
- Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. . Practical Streptomyces Genetics. , (2000).
- Vinck, A., et al. Hyphal differentiation in the exploring mycelium of Aspergillus niger. Mol. Microbiol. 58, 693-699 (2005).
- Reichl, U., King, R., Gilles, E. D. Characterization of pellet morphology during submerged growth of Streptomyces tendae by image analysis. Biotechnol. Bioeng. 39, 164-170 (1992).
