חוקר את ההשפעות של פרוביוטיקה על דלקת ריאות התיישבות שימוש<em> במבחנה</em> Assay דבקות
Summary
במבחנה יכולים לשמש מבחני דבקות ללמוד את הקובץ המצורף של Streptococcus pneumoniae לאפיתל monolayers תא ולחקור התערבויות פוטנציאליות כגון השימוש בפרוביוטיקה לעיכוב קולוניזציה ריאות.
Abstract
היצמדות של Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) לאפיתל רירית לוע האף יכולה לגרום לקולוניזציה, והוא נחשב תנאי לדלקות ריאות כגון דלקת ריאות ודלקת אוזן תיכונה. ניתן להשתמש במבחני חוץ גופית דבקות ללמוד את הקובץ המצורף של pneumococci לאפיתל תא monolayers ולחקור התערבויות פוטנציאליות, כגון השימוש בפרוביוטיקה, לעכב קולוניזציה ריאות. הפרוטוקול המתואר כאן משמש כדי לחקור את ההשפעות של salivarius סטרפטוקוקוס פרוביוטיים על הדבקות של pneumococci לשורת תאי אפיתל האנושי CCL-23 (המכונה לעתים הפ-2 תאים). Assay כרוך בשלושה שלבים עיקריים: 1) הכנה של תאי האפיתל וחיידקים, 2) תוספת של חיידקים לאפיתל monolayers תא, ו3) זיהוי של pneumococci חסיד ידי ספירת קיימא (דילול סדרתי וציפוי) או כמוני בזמן אמת PCR (qPCR ). טק זוhnique הוא פשוט יחסית ולא דורש ציוד מיוחד מלבד התקנה בתרבית רקמה. Assay יכול לשמש כדי לבדוק את המינים פרוביוטיים אחרים ו / או מעכבים פוטנציאליים של קולוניזציה דלקת ריאות וניתן לשנות בקלות כדי לענות על שאלות מדעיות אחרות בנוגע לדבקות ופלישת ריאות.
Introduction
pneumoniae Streptococcus (pneumococcus) הוא חיידק גראם חיובי שיכול לגרום לזיהומים כוללים דלקת ריאות, דלקת אוזן תיכונה, ודלקת קרום מוח. זה גורם עיקרי למחלות אצל ילדים במדינות בעלות הכנסה נמוכה ואחראים למותם משוער של 800,000 ילדים מתחת לגיל חמש בשנה 1. Pneumococci לעתים קרובות נשא בלוע אפם של ילדים צעירים. למרות התישבות זו נחשבת בדרך כלל ללא תסמינים, הוא מקדים את זיהום pneumococcal ומשמש כמאגר לחיידקים באוכלוסיות אנושיות 2. חיסון המצומד דלקת ריאות ביעילות מפחית את הכרכרה של קפסיד הכלולים בתוך החיסון. עם זאת, ישנם מעל 90 זנים אל ריאות, וחיסון יכול להוביל להחלפת סרוטיפ, לפיה החיסול של זנים אל חיסון ואחריו עלייה בכרכרה ומחלה הנגרמת על ידי זנים אל nonvaccine 3. כמו כן, בחלק מאוכלוסיות בסיכון גבוה, דלקת ריאותהתישבות מתרחשת לעתים קרובות בשלב מוקדם מאוד בחיים, לפני מתן מנת החיסון הראשונה 4,5. לאחרונה, השימוש בפרוביוטיקה הוצע כאסטרטגיה נוספת כדי לעכב 6,7 קולוניזציה pneumococcal. במבחני חוץ גופית דבקות שנוצלו כדי לבחון דבקות pneumococcal 8,9. מבחני אלה הותאמו כדי לחקור את ההשפעה של לקטובצילוס GG rhamnosus פרוביוטיים (LGG) על דבקות pneumococcal 10.
בנוסף לLGG וחיידקים חומצה לקטית אחרים, סטרפטוקוקוס salivarius, תושב נפוץ של חלל הפה, נחקר כפרוביוטיים פוטנציאל לדרכי הנשימה עקב קולוניזציה את הפוטנציאל שלה והיכולת לעכב pneumococci ופתוגנים אחרים בדרכי הנשימה במבחנה 11 – 13. הפרוטוקול המובא כאן מתאר assay דבקות בשימוש כדי לחקור את השפעותיו של ס ' salivarius K12 על דבקות pneumococcalלשורת תאי אפיתל האנושית CCL-23. לפני השימוש בassay, מבודד pneumococcal הוערכו על יכולות דבקות, כמו צמיחה ודבקות מאפיינים יכולים להשתנות באופן משמעותי בין מבודד 10,14. עקומות גדילה של pneumococci וס salivarius בוצע כדי לקבוע שלב אמצע יומן וריכוז אומדן (יחידות מושבה להרכיב או CFU / מיליליטר) על ידי צפיפות אופטית (OD, איור 1). מומלץ לבחון את הצמיחה על ידי ספירה וOD קיימא עבור כל בודד לפני השימוש בassay. assay זה יכול להתבצע בכל מעבדה עם מתקני תרבות תקן רקמות וציוד. בפרוטוקול זה, את ההשפעות של שלוש מנות של ס salivarius מנוהל 1 שעות לפני התוספת של pneumococci על דבקותו של ס ' pneumoniae PMP843, 19F בודד מרכבת סרוטיפ נגזר מספוגית האף והלוע, נבחנים. שתי דרכים שונות כדי לכמת pneumococci חסיד מוצגות: ציפוי על אגר דם כדי להרתיעשלי ספירות קיימא, ומיצוי DNA וזיהוי של גן lytA pneumococcal ידי 15 qPCR. פרוטוקול assay הדבקות הבסיסי ניתן לשנות בקלות כדי לבדוק מינונים או זמן של ממשל של פרוביוטיקה שונים ויכול לשמש גם עם זני חיידקים אחרים או מין.
Protocol
Representative Results
Discussion
חלק קריטי של assay זה הוא הוספת הריכוזים המתאימים של ס salivarius וpneumococci בסעיפי 3.1.7 ו3.1.12. ריכוזים מחושבים באמצעות קריאות OD אבל inocula המדויק לא נקבעו עד צלחות נספרות ביום המחרת. מסיבה זו, אנו ממליצים על ביצוע עקומות גדילה למדידת OD וספירת קיימא (CFU / מיליליטר) לאורך זמן עבור כ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מימון ממרדוק הילדים מכון המחקר ותכנית התמיכה בתשתית התפעולית של הממשלה ויקטוריאני.
Materials
| Minimum Essential Media (MEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30244.01 | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30084.03 | ||
| T-75 Flask | Nunc | 156472 | ||
| CCL-23 cells | ATCC | CCL-23 | ||
| Trypsin | Life Technologies | 15090046 | ||
| 24-well cell culture plate | Nunc | 142475 | ||
| Horse blood agar (HBA) plates | Oxoid | PP2001 | Sheep blood agar plates also acceptable | |
| Todd-Hewitt Broth | Oxoid | CM0189 | ||
| Yeast Extract | Beckton Dickinson | 212750 | ||
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141-100MG | ||
| Disposable cuvettes | Kartell | 1938 | ||
| Heparin | Pfizer | 2112105 | comes in sterile ampules at 5,000IU/5mL | |
| sterile spreader | Technoplas | S10805050 | alternatively, a glass spreader can be dipped in 96% ethanol and flame sterilized before each use | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | ||
| Mutanolysin | Sigma-Aldrich | M9901 | ||
| Proteinase K | Qiagen | 19133 | ||
| SDS 20% solution | Ambion | AM9820 | ||
| RNase A | Qiagen | 19101 | ||
| QIAamp DNA mini-kit (250) | Qiagen | 51306 | ||
| LytA F primer | Sigma-Aldrich | Custom made | 5' -> 3' sequence ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA | |
| LytA R primer | Sigma-Aldrich | Custom made | 5' -> 3' sequence TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT | |
| LytA probe | Eurogentec | Custom made | 5' -> 3' sequence Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternative fluorophores can be used | |
| Nuclease free water | Ambion | AM9906 | ||
| Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix | Agilent Technologies | 600880 | ||
| Thermo-Fast 96 Detection plate | Thermo Fisher Scientific | AB-1100 | ||
| Ultra clear qPCR cap strips | Thermo Fisher Scientific | AB-0866 | ||
| Mx3005 QPCR System | Agilent Technologies | 401449 | ||
| * alternative sources are available for most/all products listed | ||||
References
- O’Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
- Bogaert, D., de Groot, R., Hermans, P. W. M. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4 (04), 144-154 (2004).
- Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).
- Jacoby, P., et al. Modelling the co-occurrence of Streptococcus pneumoniae with other bacterial and viral pathogens in the upper respiratory tract. Vaccine. 25, 2458-2464 (2007).
- Kwambana, B., Barer, M., Bottomley, C., Adegbola, R., Antonio, M. Early acquisition and high nasopharyngeal co-colonisation by Streptococcus pneumoniae and three respiratory pathogens amongst Gambian new-borns and infants. BMC Infect. Dis. 11, (2011).
- Licciardi, P. V., et al. Protecting against pneumococcal disease: critical interactions between probiotics and the airway microbiome. PLoS Pathog. 8, (2012).
- Popova, M., et al. Beneficial effects of probiotics in upper respiratory tract infections and their mechanical actions to antagonize pathogens. J. Appl. Microbiol. 113 (6), 1305-1318 (2012).
- Pracht, D., et al. PavA of Streptococcus pneumoniae modulates adherence, invasion, and meningeal inflammation. Infect. Immun. 73, 2680-2689 (2005).
- Adamou, J. E., Wizemann, T. M., Barren, P., Langermann, S. Adherence of Streptococcus pneumoniae to human bronchial epithelial cells (BEAS-2B). Infect. Immun. 66, 820-822 (1998).
- Wong, S. S., et al. Inhibition of Streptococcus pneumoniae adherence to human epithelial cells in vitro by the probiotic Lactobacillus rhamnosus GG. BMC Res. Notes. 6 (1), 135 (2013).
- Wescombe, P. A., Heng, N. C. K., Burton, J. P., Chilcott, C. N., Tagg, J. R. Streptococcal bacteriocins and the case for Streptococcus salivarius as model oral probiotics. Future Microbiol. 4, 819-835 (2009).
- Di Pierro, F., Adami, T., Rapacioli, G., Giardini, N., Streitberger, C. Clinical evaluation of the oral probiotic Streptococcus salivarius K12 in the prevention of recurrent pharyngitis and/or tonsillitis caused by Streptococcus pyogenes in adults. Expert. Opin. Biol. Ther. 13 (3), 339-343 (2013).
- Fiedler, T., et al. Protective mechanisms of respiratory tract streptococci against Streptococcus pyogenes biofilm formation and epithelial cell infection. Appl. Environ. Microbiol. 79, 1265-1276 (2013).
- Slotved, H. C., Satzke, C. In vitro growth of pneumococcal isolates representing 23 different serotypes. BMC Res. Notes. 6, 10-1186 (2013).
- Carvalho, M. d. G. S., et al. Evaluation and improvement of real-time PCR assays targeting lytA, ply, and psaA genes for detection of pneumococcal DNA. J. Clin. Microbiol. 45, 2460-2466 (2007).
- Tonnaer, E. L. G. M., et al. Involvement of glycosaminoglycans in the attachment of pneumococci to nasopharyngeal epithelial cells. Microbes Infect. 8, 316-322 (2006).
- Smith-Vaughan, H., et al. Measuring nasal bacterial load and its association with otitis media. BMC Ear Nose Throat Disord. 6, (2006).
- Letourneau, J., Levesque, C., Berthiaume, F., Jacques, M., Mourez, M. In vitro assay of bacterial adhesion onto mammalian epithelial cells. J. Vis. Exp. , (2011).
