Cecal ligature et ponction induite Sepsis comme un modèle pour étudier autophagie chez les souris
Summary
La septicémie expérimentale peut être induite chez des souris en utilisant la méthode (CLP) ligature caecale et ponction. Les protocoles actuels pour évaluer autophagy in vivo dans le cadre de la sepsie induite par CLP sont présentés ici: Un protocole pour la mesure en utilisant des souris autophagy (GFP)-LC3, et d'un protocole de mesure de la formation de autophagosome par microscopie électronique.
Abstract
La septicémie expérimentale peut être induite chez des souris en utilisant la méthode (CLP), qui provoque une septicémie à germes multiples ligature caecale et ponction. Ici, il est prévu un protocole d'induire sepsis de gravité variable chez les souris en utilisant la technique de la CLP. Autophagy est une réponse du tissu fondamental au stress et à l'invasion de pathogènes. Deux protocoles actuels pour évaluer autophagy in vivo dans le cadre de la septicémie expérimentale sont également présentés ici. (I) Les souris transgéniques exprimant la protéine de fluorescence verte de la protéine (GFP)-LC3 fusion sont soumis au règlement CLP. Amélioration localisée du signal de la GFP (puncta), telle que déterminée soit par des dosages immunohistochimiques ou confocale, peut être utilisé pour détecter la formation de autophagosome améliorée et, par conséquent, l'activation de la voie modifiée autophagy. (II) Enhanced vacuole autophagique (autophagosome) formation par aire unitaire de tissu (en tant que marqueur de stimulation autophagy) peut être quantifiée en utilisant la microscopie électronique. L'étude des réponses autophagiques à la septicémie est un échantillon critiqueonent de comprendre les mécanismes par lesquels les tissus répondent à l'infection. Les résultats des recherches dans ce domaine peuvent finalement contribuer à la compréhension de la pathogenèse de la septicémie, ce qui représente un problème majeur en médecine de soins intensifs.
Introduction
Septicémie, une réponse inflammatoire systémique à l'infection, représente une des principales causes de décès chez les patients gravement malades 1. Infections intra-abdominales, conduisant souvent à une septicémie polymicrobienne, compte pour 20% des cas de septicémie, qui ont une mortalité importante de jusqu'à 60% 2. la mortalité associée au sepsis résulte principalement de dysfonction d'organes multiples avec défaillance organique ultérieure 3,4. Complément d'enquête dans le mécanisme pathogène de cette maladie est urgent de promouvoir le développement de thérapies nouvelles et plus efficaces.
La méthode ligature du caecum et à la perforation (CLP) est une procédure couramment utilisée pour la modélisation sepsis in vivo. Comme le caecum est pleine de bactéries, les résultats de ponction dans péritonite polymicrobiens, la translocation de bactéries dans le sang (bactériémie), le choc septique, la dysfonction d'organes multiples et, finalement, la mort 5. Il est généralement admis que CLP reflète cliniquela réalité avec plus de précision que les techniques antérieures, telles que l'injection d'endotoxine ou de bactéries, même purifiés à des rongeurs, ainsi CLP est considéré comme l'étalon-or (mais pas sans limites) 6 pour l'induction expérimentale, et donc, l'enquête de la pathogenèse de la septicémie. Dans cette monographie, nous décrivons les protocoles visant à évaluer si les mécanismes pathogènes de la septicémie comprennent l'autophagie.
L'autophagie, un processus cellulaire évolutif conservé, facilite le renouvellement des protéines et des organites tels que les mitochondries endommagées et joue un rôle important dans la clairance des pathogènes intracellulaires, y compris les bactéries 7,8. Au cours de l'autophagie, des protéines ou des organites cytoplasmiques sont séquestrés dans des vésicules à double membranaires appelées autophagosomes, qui sont ensuite livrées aux lysosomes pour la dégradation 9. Plusieurs protéines ont été identifiées comme des homologues mammifères de gènes liés autophagy-(ATG),initialement identifiées dans la levure, qui réglemente le processus de l'autophagie. La conversion de la chaîne légère associée aux microtubules protéines 1 3B (LC3B) (homologue de Atg8) de LC3B-I (forme libre) à LC3B-II (forme de phosphatidyléthanolamine-conjugué) représente une étape importante dans la formation autophagosome 9. Dysfonction autophagie est associée au vieillissement et les maladies humaines telles que le cancer et les maladies neurodégénératives 10. En outre, autophagy affecte l'immunité innée et adaptative tel que la présentation d'antigène, le développement des lymphocytes et la sécrétion de cytokines par les cellules immunitaires 8. Ainsi, il semble raisonnable que l'autophagie pourrait également jouer un rôle dans la réponse inflammatoire systémique à l'infection (c'est à dire dans le sepsis).
A ce jour plusieurs méthodes ont été décrites pour évaluer le rôle de l'autophagie des blessures des tissus in vivo. Ceux-ci comprennent l'utilisation de souris exprimant la protéine de fluorescence verte (GFP)-LC3 et la quantification de l'automobilephagosomes dans les tissus par microscopie électronique (ces deux méthodes sont décrites dans cette monographie). D'autres méthodes incluent la quantification de l'expression de la protéine autophagique dans les homogénats de tissus, et l'analyse des flux autophagique (comme décrit ailleurs) 11-13. L'objectif de cette étude est de fournir les protocoles actuels pour évaluer l'autophagie in vivo dans le cadre de la septicémie expérimentale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le principal avantage de CLP est qu'il permet aux chercheurs d'étudier la septicémie de différents niveaux de gravité (c'est à dire de faible à moyenne et haute qualité). La gravité de la septicémie induite est affecté par la longueur du caecum ligaturé (dont le déterminant le plus important), la taille de l'aiguille utilisée pour percer et le nombre de trous 15 réalisés. En outre, la souche de souris et le sexe peut avoir une incidence sur la gravité de la septicémie…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| GFP-LC3 Transgenic Mice | Riken (Japan) | RBRC00806 | GFP-LC3#53 |
| Xylazine | Henry-Schein | 568-0606 | Xylazine HCl Injection Vet |
| Ketamine | Henry-Schein | 995-2949 | Ketaset Inj 100 mg/ml |
| EtOH | Fisher | A405-20 | Histology Grade |
| EtOH | Fisher | A407-1 | For Sterilizatiion |
| silk surgical sutures 6-0 | Owens & Minor | 2300-0078OG, 017624 | |
| buprenorphine-HCl | Henry-Schein | 614-5157 | Buprenex Ampules |
| paraformaldehyde (37%) solution | JT Baker | S898-09 | |
| xylenes | Fisher | X3P-1GAL | |
| anti-GFP monoclonal antibody | Life Technologies | G10362 | |
| Hoescht | Sigma | 944403 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| OCT | VWR scientific | 25608-930 | |
| Sudan Black | Santa Cruz | sc-203760 | |
| EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate | Electron microscopy Sciences | 15960 | |
| propylene oxide | Sigma | 240397 | |
| Agar 100 resin | Agar scientific | R1045 | |
| dodecenylsuccinic anhydride | Sigma | 46346 | |
| methylnadic anhydride | Sigma | 45359 | |
| N-benzyldimethylamine | Sigma | 185582 |
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