Cecal Ligation och Punktering-inducerad Sepsis som en modell för att studera Autophagy i möss
Summary
Experimentell sepsis kan induceras i möss med användning av cecal ligation och punkteringsmetod (CLP). Nuvarande protokoll för att bedöma autophagy in vivo i samband med CLP-inducerad sepsis presenteras här: Ett protokoll för mätning av autophagy med användning av (GFP)-LC3 möss, och ett protokoll för att mäta autophagosome bildning genom elektronmikroskopi.
Abstract
Experimentell sepsis kan induceras i möss med användning av cecal ligation och punkteringsmetod (CLP), som orsakar polymikrobiella sepsis. Här är ett protokoll som att framkalla sepsis av varierande svårighetsgrad hos möss med hjälp av kommandotolken tekniken. Autophagy är en grundläggande vävnadssvaret på stress och patogen invasion. Två strömprotokoll för att bedöma autophagy in vivo i samband med experimentell sepsis presenteras också här. (I) Transgena möss som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP)-LC3 fusionsprotein utsattes för CLP. Lokaliserad förstärkning av GFP-signal (puncta), som analyserades antingen genom immunohistokemiska eller konfokala analyser kan användas för att detektera ökad autophagosome bildning och sålunda ändras aktiveringen av autophagy reaktionsväg. (II) Förstärkt autophagic vakuolen (autophagosome) bildande per enhetsvävnadsområde (som en markör för autophagy stimulering) kan kvantifieras med hjälp av elektronmikroskopi. Studien av autophagic svar till sepsis är en kritisk komponent av att förstå de mekanismer genom vilka vävnader svarar på infektion. Forskningsresultat inom detta område kan i slutändan bidra till ökad förståelse för uppkomsten av blodförgiftning, vilket är ett stort problem inom intensivvård medicin.
Introduction
Sepsis, en systemisk inflammatorisk reaktion på infektion, är en ledande dödsorsak i kritiskt sjuka patienter 1. Intraabdominella infektioner, ofta leder till polymikrobiella sepsis, står för 20% av sepsis, som har betydande dödlighet på upp till 60% 2. Sepsis-associerad dödlighet resulterar i första hand från multiorgandysfunktion med efterföljande organsvikt 3,4. Ytterligare utredning av patogena mekanismen av denna sjukdom krävs snarast för att främja utvecklingen av nya och mer effektiva behandlingar.
Den cecal ligation och punktering (CLP)-metoden är ett vanligt använt förfarande för modellering sepsis in vivo. Som blindtarmen är full av bakterier, dess punkterings leder polymikrobiella peritonit, translokation av bakterier i blodet (bakteriemi), septisk chock, flerorgandysfunktion och slutligen död 5. Det är allmänt accepterat att CLP avspeglar kliniskverkligheten mer exakt än tidigare tekniker, såsom injektion av endotoxin eller renade bakterier i gnagare, alltså CLP anses guldmyntfoten (om än inte utan begränsningar) 6 för experimentell induktion och därmed utredningen av patogenesen av sepsis. I denna monografi, beskriver vi protokoll som syftar till att bedöma om patogena mekanismer för sepsis inkluderar autophagy.
Autophagy, ett evolutionärt bevarat cellulär process, underlättar omsättningen av skadade proteiner och organeller såsom mitokondrier och spelar en viktig roll vid clearance av intracellulära patogener, inklusive bakterier 7,8. Under autophagy är cytosoliska proteiner eller organeller binds till dubbelmembranbundna vesiklar kallade autophagosomes, som sedan levereras till lysosomer för nedbrytning 9. Ett antal proteiner har identifierats som de däggdjurshomologer av autophagy relaterade gener (ATG),ursprungligen identifierats i jäst, som reglerar processen med autophagy. Omvandlingen av mikrotubuli-associerat protein-1 lätt kedja 3B (LC3B) (homolog av Atg8) från LC3B-I (fri form) att LC3B-II (fosfatidyletanolamin-konjugerad form) är ett stort steg i autophagosome formation 9. Autophagic dysfunktion är förknippad med åldrande och mänskliga sjukdomar, inklusive cancer och neurodegenerativa sjukdomar 10. Dessutom påverkar autophagy medfödd och adaptiv immunitet, såsom antigenpresentation, lymfocytutveckling och cytokinutsöndring av immunceller 8. Sålunda förefaller det rimligt att autophagy också kan spela en roll i det systemiska inflammatoriska svaret på infektion (dvs sepsis).
Hittills flera förfaranden har beskrivits för att utvärdera rollen av autophagy i vävnadsskada in vivo. Dessa inkluderar användning av grönt fluorescerande protein (GFP)-LC3 uttrycker möss och kvantifiering av autophagosomes i vävnad genom elektronmikroskopi (dessa två metoder beskrivs i denna monografi). Ytterligare metoder innefattar kvantifiering av autophagic proteinuttryck i vävnadshomogenat, och analysen av autophagic flussmedel (som beskrivits på annat ställe) 11-13. Målet med denna översyn är att ge nuvarande protokoll för bedömning autophagy in vivo i samband med experimentell sepsis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den stora fördelen med CLP är att det tillåter forskare att undersöka sepsis av olika svårighetsgrader (dvs. från låg-till mitten och hög kvalitet). Allvarlighetsgrad av inducerad sepsis påverkas av längden på blindtarmen ligeras (som den viktigaste faktorn), storleken på nålen som används för punktering och antalet hål utfört 15. Dessutom kan musen stam och kön påverka svårighetsgraden av sepsis, flera stammar är mer mottagliga än andra och män är generellt mer känsliga än …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| GFP-LC3 Transgenic Mice | Riken (Japan) | RBRC00806 | GFP-LC3#53 |
| Xylazine | Henry-Schein | 568-0606 | Xylazine HCl Injection Vet |
| Ketamine | Henry-Schein | 995-2949 | Ketaset Inj 100 mg/ml |
| EtOH | Fisher | A405-20 | Histology Grade |
| EtOH | Fisher | A407-1 | For Sterilizatiion |
| silk surgical sutures 6-0 | Owens & Minor | 2300-0078OG, 017624 | |
| buprenorphine-HCl | Henry-Schein | 614-5157 | Buprenex Ampules |
| paraformaldehyde (37%) solution | JT Baker | S898-09 | |
| xylenes | Fisher | X3P-1GAL | |
| anti-GFP monoclonal antibody | Life Technologies | G10362 | |
| Hoescht | Sigma | 944403 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| OCT | VWR scientific | 25608-930 | |
| Sudan Black | Santa Cruz | sc-203760 | |
| EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate | Electron microscopy Sciences | 15960 | |
| propylene oxide | Sigma | 240397 | |
| Agar 100 resin | Agar scientific | R1045 | |
| dodecenylsuccinic anhydride | Sigma | 46346 | |
| methylnadic anhydride | Sigma | 45359 | |
| N-benzyldimethylamine | Sigma | 185582 |
References
- Hotchkiss, R. S., Karl, I. E. The pathology and treatment of sepsis. N. Engl. J. Med. 348, 138-150 (2003).
- Anaya, D. A., Nathens, A. B. Risk factors for severe sepsis in secondary peritonitis. Surg. Infect. 4, 355-362 (2003).
- Bone, R. C., Grodzin, C. J., Balk, R. A. Sepsis: A new hypothesis for pathogenesis of the disease process. Chest. 112, 235-243 (1997).
- Rivers, E., Med, s. h. o. c. k. .. N. .. E. n. g. l. .. J. .., et al. Early goal-directed therapy in the treatment of severe sepsis and septic shock. N. Engl. J. Med.. 345, 1368-1377 (2001).
- Deitch, E. A. Rodent models of intra-abdominal infection. Shock. 24 (Suppl 1), 19-23 (2005).
- Raven, K. Rodent models of sepsis found shockingly lacking. Nat. Med. 18, 998 (2012).
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132, 27-42 (2008).
- Virgin, H. W., Levine, B. Autophagy genes in immunity. Nat. Immunol. 10, 461-470 (2009).
- Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
- Choi, A. M., Ryter, S. W., Levine, B. Autophagy in human health and disease. N. Engl. J. Med. 368, 651-662 (2013).
- Haspel, J., et al. Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay. Autophagy. 7, 629-642 (2011).
- Chen, Z. H., et al. Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease. PLos One. 3, 3313 (2008).
- Kim, H. P., Chen, Z. H., Choi, A. M., Ryter, S. W. Analyzing autophagy in clinical tissues of lung and vascular diseases. Meth. Enzymol. 453, 197-216 (2009).
- Flierl, M. A., et al. Adverse functions of IL-17A in experimental sepsis. FASEB J. 22, 2198-2205 (2008).
- Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nat. Protoc. 4, 31-36 (2009).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140, 313-326 (2010).
- Wang, L., Ma, R., Flavell, R. A., Choi, M. E. Requirement of mitogen-activated protein kinase kinase 3 (MKK3) for activation of p38α and p38δ MAPK isoforms by TGF-β1 in murine mesangial cells. J. Biol. Chem. 277, 47257-47262 (2002).
- Ding, Y., Kim, J. K., Kim, S. I., Na, H. J., Jun, S. Y., Lee, S. J., Choi, M. E. TGF-{beta}1 protects against mesangial cell apoptosis via induction of autophagy. J Biol Chem. 285, 37909-37919 (2010).
- Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. Surgery. 94, 331-335 (1983).
- Godshall, C. J., Scott, M. J., Peyton, J. C., Gardner, S. A., Cheadle, W. G. Genetic background determines susceptibility during murine septic peritonitis. J. Surg. Res. 102, 45-49 (2002).
- Carchman, E. H., Rao, J., Loughran, P. A., Rosengart, M. R., Zuckerbraun, B. S. Heme oxygenase-1-mediated autophagy protects against hepatocyte cell death and hepatic injury from infection/sepsis in mice. Hepatology. 53, 2053-2062 (2011).
- Lo, S., et al. Lc3 over-expression improves survival and attenuates lung injury through increasing autophagosomal clearance in septic mice. Ann. Surg. 257, 352-363 (2013).
