Cecal קשירת ונקר-Induced אלח דם כמודל ללמוד Autophagy בעכברים
Summary
אלח דם ניסיוני יכול להיגרם בעכברים באמצעות קשירת cecal ולנקב שיטה (CLP). פרוטוקולים הנוכחיים להעריך autophagy in vivo בהקשר של אלח דם הנגרם CLP מוצגים כאן: פרוטוקול למדידת autophagy באמצעות עכברים (GFP)-LC3, ופרוטוקול למדידת היווצרות autophagosome על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים.
Abstract
אלח דם ניסיוני יכול להיגרם בעכברים באמצעות קשירת cecal ולנקב שיטה (CLP), הגורם לאלח דם polymicrobial. כאן, פרוטוקול מסופק לגרום אלח דם של חומרה שונה בעכברים תוך שימוש בטכניקת CLP. Autophagy הוא תגובת רקמה בסיסית ללחץ ופלישת הפתוגן. שני פרוטוקולים הנוכחיים להעריך autophagy in vivo בהקשר של אלח דם ניסיוני מוצגים גם כאן. (אני) עכברים הטרנסגניים לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק חלבון היתוך (GFP)-LC3 חשופים לCLP. שיפור מקומי של אות ה-GFP (puncta), כassayed או על ידי מבחני immunohistochemical או confocal, יכול לשמש כדי לזהות היווצרות autophagosome משופרת, ולכן הפעלה שונתה, של מסלול autophagy. (II) היווצרות vacuole autophagic המשופרת (autophagosome) לאזור רקמת יחידה (כסמן של גירוי autophagy) ניתן לכמת באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים. המחקר של תגובות autophagic לאלח הדם הוא חינמון קריטיonent להבין את המנגנונים שבאמצעותם רקמות מגיבות לזיהום. ממצאי מחקר בתחום זה עשויים בסופו לתרום להבנת הפתוגנזה של אלח דם, המייצגת את אחת בעיות עיקריות ברפואה בטיפול נמרצת.
Introduction
אלח דם, תגובה דלקתית מערכתית לזיהום, מייצג גורם מוביל למוות בחולים ביקורתי חולים 1. זיהומי התוך בטני, לעתים קרובות מובילים לאלח דם polymicrobial, חשבון 20% מהמקרים אלח דם, שבו יש תמותה משמעותית של עד 60% 2. התמותה הקשורים אלח דם נובעת בעיקר מבעיות של מרובי איברים עם כשל איברים לאחר 3,4. יש צורך בחקירה נוסף לתוך המנגנון הפתוגני של מחלה זו בדחיפות כדי לקדם את הפיתוח של טיפולים חדשניים ויעילים יותר.
שיטת קשירה ולנקב cecal (CLP) היא הליך נפוץ לאלח דם דוגמנות in vivo. כcecum מלא בחיידקים, תוצאות לנקבו בדלקת הצפק polymicrobial, טרנסלוקציה של חיידקים לדם (בקטרמיה), הלם ספטי, תפקוד לקוי של איברים רב, וסופו של דבר, למוות 5. הדעה מקובלת היא שCLP משקף קלינימציאות בצורה מדויקת יותר מאשר טכניקות קודמות, כגון הזרקה של רעלן פנימי או חיידקים אפילו מטוהרים למכרסמים, וכך, CLP נחשבת את תקן זהב (אם כי לא בלי מגבלות) 6 לאינדוקציה ניסיוני, ולכן, החקירה של הפתוגנזה של אלח דם. במונוגרפיה זו, אנו מתארים פרוטוקולים נועדו להעריך אם מנגנונים פתוגניים של אלח דם כוללים autophagy.
Autophagy, תהליך סלולארי אבולוציונית שימור, מאפשר התחלופה של חלבונים ואברונים כגון המיטוכונדריה פגומים וממלא תפקיד חשוב בסילוק פתוגנים תאיים כוללים חיידקים 7,8. במהלך autophagy, חלבונים או אברונים cytosolic הם מוחרמים לתוך שלפוחית כפולה קרום הנכנס נקראת autophagosomes, אשר מועברות לאחר מכן לlysosomes לפירוק 9. מספר החלבונים זוהה כhomologues היונקים של גנים הקשורים לautophagy (ATG),זוהה במקור בשמרים, המסדירים את התהליך של autophagy. ההמרה של שרשרת אור microtubule הקשורים החלבון -1 3B (LC3B) (homologue של Atg8) מLC3B-I (בצורה חופשית) לLC3B-II (טופס phosphatidylethanolamine מצומדות) מהווה צעד חשוב בהיווצרות autophagosome 9. תפקוד לקוי autophagic הוא הקשורות להזדקנות ומחלות אנושיות, כולל סרטן ומחלות ניווניות 10. יתר על כן, autophagy משפיע על חסינות מולדת ובעלי כושר הסתגלות כגון מצגת אנטיגן, פיתוח הלימפוציטים והפרשת ציטוקינים על ידי תאי מערכת החיסון 8. לפיכך, נראה סביר שautophagy עשוי גם לשחק תפקיד בתגובה הדלקתית המערכתית לזיהום (כלומר באלח דם).
נכון להיום מספר שיטות שתוארו על מנת להעריך את התפקיד של autophagy בפגיעה ברקמות בגוף חי. אלה כוללים את השימוש בעכברים לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)-LC3 וכימות של רכבphagosomes ברקמה על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים (אלה שתי שיטות מתוארות במונוגרפיה זו). שיטות נוספות כוללות כימות של ביטוי חלבון autophagic בhomogenates רקמות, וניתוח של שטף autophagic (כפי שמתואר במקום אחר) 11-13. מטרת סקירה זו היא לספק פרוטוקולים הנוכחיים להערכת autophagy in vivo בהקשר של אלח דם ניסיוני.
Protocol
Representative Results
Discussion
היתרון העיקרי של CLP הוא שהיא מאפשרת לחוקרים לחקור אלח דם של חומרות שונות (כלומר מנמוך לכיתה גבוהה באמצע ו). חומרה של אלח דם הנגרם מושפעת אורך cecum ligated (שהקובע החשוב ביותר), בגודל של מחט המשמשת לניקור ומספר החורים ביצעו 15. בנוסף, זן העכבר והמין יכולים להשפיע על ה…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| GFP-LC3 Transgenic Mice | Riken (Japan) | RBRC00806 | GFP-LC3#53 |
| Xylazine | Henry-Schein | 568-0606 | Xylazine HCl Injection Vet |
| Ketamine | Henry-Schein | 995-2949 | Ketaset Inj 100 mg/ml |
| EtOH | Fisher | A405-20 | Histology Grade |
| EtOH | Fisher | A407-1 | For Sterilizatiion |
| silk surgical sutures 6-0 | Owens & Minor | 2300-0078OG, 017624 | |
| buprenorphine-HCl | Henry-Schein | 614-5157 | Buprenex Ampules |
| paraformaldehyde (37%) solution | JT Baker | S898-09 | |
| xylenes | Fisher | X3P-1GAL | |
| anti-GFP monoclonal antibody | Life Technologies | G10362 | |
| Hoescht | Sigma | 944403 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| OCT | VWR scientific | 25608-930 | |
| Sudan Black | Santa Cruz | sc-203760 | |
| EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate | Electron microscopy Sciences | 15960 | |
| propylene oxide | Sigma | 240397 | |
| Agar 100 resin | Agar scientific | R1045 | |
| dodecenylsuccinic anhydride | Sigma | 46346 | |
| methylnadic anhydride | Sigma | 45359 | |
| N-benzyldimethylamine | Sigma | 185582 |
References
- Hotchkiss, R. S., Karl, I. E. The pathology and treatment of sepsis. N. Engl. J. Med. 348, 138-150 (2003).
- Anaya, D. A., Nathens, A. B. Risk factors for severe sepsis in secondary peritonitis. Surg. Infect. 4, 355-362 (2003).
- Bone, R. C., Grodzin, C. J., Balk, R. A. Sepsis: A new hypothesis for pathogenesis of the disease process. Chest. 112, 235-243 (1997).
- Rivers, E., Med, s. h. o. c. k. .. N. .. E. n. g. l. .. J. .., et al. Early goal-directed therapy in the treatment of severe sepsis and septic shock. N. Engl. J. Med.. 345, 1368-1377 (2001).
- Deitch, E. A. Rodent models of intra-abdominal infection. Shock. 24 (Suppl 1), 19-23 (2005).
- Raven, K. Rodent models of sepsis found shockingly lacking. Nat. Med. 18, 998 (2012).
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132, 27-42 (2008).
- Virgin, H. W., Levine, B. Autophagy genes in immunity. Nat. Immunol. 10, 461-470 (2009).
- Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
- Choi, A. M., Ryter, S. W., Levine, B. Autophagy in human health and disease. N. Engl. J. Med. 368, 651-662 (2013).
- Haspel, J., et al. Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay. Autophagy. 7, 629-642 (2011).
- Chen, Z. H., et al. Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease. PLos One. 3, 3313 (2008).
- Kim, H. P., Chen, Z. H., Choi, A. M., Ryter, S. W. Analyzing autophagy in clinical tissues of lung and vascular diseases. Meth. Enzymol. 453, 197-216 (2009).
- Flierl, M. A., et al. Adverse functions of IL-17A in experimental sepsis. FASEB J. 22, 2198-2205 (2008).
- Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nat. Protoc. 4, 31-36 (2009).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140, 313-326 (2010).
- Wang, L., Ma, R., Flavell, R. A., Choi, M. E. Requirement of mitogen-activated protein kinase kinase 3 (MKK3) for activation of p38α and p38δ MAPK isoforms by TGF-β1 in murine mesangial cells. J. Biol. Chem. 277, 47257-47262 (2002).
- Ding, Y., Kim, J. K., Kim, S. I., Na, H. J., Jun, S. Y., Lee, S. J., Choi, M. E. TGF-{beta}1 protects against mesangial cell apoptosis via induction of autophagy. J Biol Chem. 285, 37909-37919 (2010).
- Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. Surgery. 94, 331-335 (1983).
- Godshall, C. J., Scott, M. J., Peyton, J. C., Gardner, S. A., Cheadle, W. G. Genetic background determines susceptibility during murine septic peritonitis. J. Surg. Res. 102, 45-49 (2002).
- Carchman, E. H., Rao, J., Loughran, P. A., Rosengart, M. R., Zuckerbraun, B. S. Heme oxygenase-1-mediated autophagy protects against hepatocyte cell death and hepatic injury from infection/sepsis in mice. Hepatology. 53, 2053-2062 (2011).
- Lo, S., et al. Lc3 over-expression improves survival and attenuates lung injury through increasing autophagosomal clearance in septic mice. Ann. Surg. 257, 352-363 (2013).
