Cecal ligatur og Punktering-induceret sepsis som en model til at studere Autophagy i mus
Summary
Eksperimentel sepsis kan induceres i mus ved hjælp af den cecal ligatur og punktering (CLP) metode. Nuværende protokoller for at vurdere autofagi in vivo i forbindelse med CLP-induceret sepsis præsenteres her: En protokol til måling autofagi anvendelse af (GFP)-LC3 mus og en protokol til måling af autophagosome dannelse ved elektronmikroskopi.
Abstract
Eksperimentel sepsis kan induceres i mus ved anvendelse cecal ligatur og punktering (CLP)-metoden, som forårsager polymikrobielle sepsis. Her er en protokol, forudsat at fremkalde sepsis af varierende sværhedsgrad i mus ved hjælp af CLP teknik. Autophagy er en grundlæggende væv reaktion på stress og patogeninvasion. To nuværende protokoller for at vurdere autofagi in vivo i forbindelse med eksperimentelle sepsis også præsenteret her. (I) Transgene mus, som udtrykker grønt fluorescensprotein (GFP)-LC3 fusionsprotein underkastes CLP. Lokaliseret forbedring af GFP signal (puncta), som analyseret enten ved immunohistokemiske eller konfokale assays kan anvendes til at påvise øget autophagosome dannelse og dermed ændret aktivering af autofagi vej. (II) Udvidet autophagic vacuole (autophagosome) dannelse pr vævsareal (som en markør for autofagi stimulation) kan kvantificeres ved hjælp af elektronmikroskopi. Studiet af autophagic reaktioner sepsis er en kritisk component at forstå de mekanismer, som væv reagerer på infektion. Forskningsresultater på dette område kan i sidste ende bidrage til at forstå patogenesen af sepsis, som repræsenterer et stort problem i intensivbehandling medicin.
Introduction
Sepsis, systemisk inflammatorisk respons på infektion, er en førende dødsårsag i kritisk-syge patienter 1. Intra-abdominale infektioner, der ofte fører til polymikrobiale sepsis, tegner sig for 20% af sepsistilfælde, som har en betydelig dødelighed på op til 60% 2. Sepsis-associeret dødelighed primært skyldes multi-organsvigt med fiasko efterfølgende orgel 3,4. Yderligere undersøgelse af patogene mekanisme af denne sygdom er et presserende behov for at fremme udviklingen af nye og mere effektive behandlingsformer.
Cecal ligatur og punktering (CLP)-metoden er en almindeligt anvendt procedure for modellering sepsis in vivo. Som coecum er fuld af bakterier, dets punktur resulterer i polymikrobielle peritonitis, translokation af bakterier i blodet (bakteriæmi), septisk shock, multi-organsvigt og i sidste ende død 5. Det er generelt accepteret, at CLP afspejler den kliniskevirkeligheden mere præcist end tidligere teknikker, såsom injektion af endotoxin eller endda oprensede bakterier i gnavere Således CLP betragtes som den gyldne standard (omend ikke uden begrænsninger) 6 for den eksperimentelle induktion og dermed undersøgelse af patogenesen af sepsis. I denne monografi beskriver vi protokoller, designet til at vurdere, om patogene mekanismer sepsis omfatter autofagi.
Autophagy, en evolutionært bevaret cellulær proces, letter omsætningen af beskadigede proteiner og organeller, såsom mitokondrier og spiller en vigtig rolle ved udskillelsen af intracellulære patogener, herunder bakterier 7,8. Under autophagy, er cytosoliske proteiner eller organeller afsondret i dobbelt membran-bundne vesikler kaldet autophagosomes, som efterfølgende leveres til lysosomerne for nedbrydningen 9. En række proteiner er blevet identificeret som mammale homologer af autophagy-relaterede gener (ATG),oprindeligt identificeret i gær, der regulerer processen autofagi. Omdannelsen af mikrotubuli-associeret protein-1 let kæde 3B (LC3B) (homolog af Atg8) fra LC3B-I (fri form) til LC3B-II (phosphatidylethanolamin-konjugeret form) er et stort skridt i autophagosome formation 9. Autophagic dysfunktion er forbundet med aldring og menneskelige sygdomme, herunder kræft og neurodegenerative sygdomme 10. Desuden autofagi påvirker medfødte og adaptive immunitet, såsom antigen-præsentation, lymfocyt udvikling og cytokinsekretion af immunceller 8. Det synes således rimeligt, at autofagi også kan spille en rolle i systemisk inflammatorisk respons på infektion (dvs. i sepsis).
Til dato er blevet beskrevet flere metoder til at vurdere den rolle autophagy i vævsskade in vivo. Disse omfatter anvendelse af grønne fluorescensprotein (GFP)-LC3 udtrykkende mus og kvantificering af autophagosomes i væv ved elektronmikroskopi (disse to metoder er beskrevet i denne monografi). Yderligere metoder omfatter kvantificering af autophagic protein udtryk i vævshomogenater, og analysen af autophagic flux (som beskrevet andetsteds) 11-13. Målet med denne gennemgang er at give nuværende protokoller til vurdering autofagi in vivo i forbindelse med eksperimentel sepsis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den største fordel ved CLP er, at det giver forskerne at undersøge sepsis forskellige sværhedsgrader (dvs. fra lav-til midt-og high-grade). Sværhedsgraden af induceret sepsis påvirkes af længden af coecum ligeret (som den vigtigste faktor), størrelsen af nålen, brugt til punktur og antallet af huller udført 15. Desuden kan musen stamme og køn indflydelse på sværhedsgraden af sepsis, flere stammer er mere modtagelige end andre, og mænd er generelt mere modtagelige end hunnerne 19,20….
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| GFP-LC3 Transgenic Mice | Riken (Japan) | RBRC00806 | GFP-LC3#53 |
| Xylazine | Henry-Schein | 568-0606 | Xylazine HCl Injection Vet |
| Ketamine | Henry-Schein | 995-2949 | Ketaset Inj 100 mg/ml |
| EtOH | Fisher | A405-20 | Histology Grade |
| EtOH | Fisher | A407-1 | For Sterilizatiion |
| silk surgical sutures 6-0 | Owens & Minor | 2300-0078OG, 017624 | |
| buprenorphine-HCl | Henry-Schein | 614-5157 | Buprenex Ampules |
| paraformaldehyde (37%) solution | JT Baker | S898-09 | |
| xylenes | Fisher | X3P-1GAL | |
| anti-GFP monoclonal antibody | Life Technologies | G10362 | |
| Hoescht | Sigma | 944403 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| OCT | VWR scientific | 25608-930 | |
| Sudan Black | Santa Cruz | sc-203760 | |
| EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate | Electron microscopy Sciences | 15960 | |
| propylene oxide | Sigma | 240397 | |
| Agar 100 resin | Agar scientific | R1045 | |
| dodecenylsuccinic anhydride | Sigma | 46346 | |
| methylnadic anhydride | Sigma | 45359 | |
| N-benzyldimethylamine | Sigma | 185582 |
References
- Hotchkiss, R. S., Karl, I. E. The pathology and treatment of sepsis. N. Engl. J. Med. 348, 138-150 (2003).
- Anaya, D. A., Nathens, A. B. Risk factors for severe sepsis in secondary peritonitis. Surg. Infect. 4, 355-362 (2003).
- Bone, R. C., Grodzin, C. J., Balk, R. A. Sepsis: A new hypothesis for pathogenesis of the disease process. Chest. 112, 235-243 (1997).
- Rivers, E., Med, s. h. o. c. k. .. N. .. E. n. g. l. .. J. .., et al. Early goal-directed therapy in the treatment of severe sepsis and septic shock. N. Engl. J. Med.. 345, 1368-1377 (2001).
- Deitch, E. A. Rodent models of intra-abdominal infection. Shock. 24 (Suppl 1), 19-23 (2005).
- Raven, K. Rodent models of sepsis found shockingly lacking. Nat. Med. 18, 998 (2012).
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132, 27-42 (2008).
- Virgin, H. W., Levine, B. Autophagy genes in immunity. Nat. Immunol. 10, 461-470 (2009).
- Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
- Choi, A. M., Ryter, S. W., Levine, B. Autophagy in human health and disease. N. Engl. J. Med. 368, 651-662 (2013).
- Haspel, J., et al. Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay. Autophagy. 7, 629-642 (2011).
- Chen, Z. H., et al. Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease. PLos One. 3, 3313 (2008).
- Kim, H. P., Chen, Z. H., Choi, A. M., Ryter, S. W. Analyzing autophagy in clinical tissues of lung and vascular diseases. Meth. Enzymol. 453, 197-216 (2009).
- Flierl, M. A., et al. Adverse functions of IL-17A in experimental sepsis. FASEB J. 22, 2198-2205 (2008).
- Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nat. Protoc. 4, 31-36 (2009).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140, 313-326 (2010).
- Wang, L., Ma, R., Flavell, R. A., Choi, M. E. Requirement of mitogen-activated protein kinase kinase 3 (MKK3) for activation of p38α and p38δ MAPK isoforms by TGF-β1 in murine mesangial cells. J. Biol. Chem. 277, 47257-47262 (2002).
- Ding, Y., Kim, J. K., Kim, S. I., Na, H. J., Jun, S. Y., Lee, S. J., Choi, M. E. TGF-{beta}1 protects against mesangial cell apoptosis via induction of autophagy. J Biol Chem. 285, 37909-37919 (2010).
- Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. Surgery. 94, 331-335 (1983).
- Godshall, C. J., Scott, M. J., Peyton, J. C., Gardner, S. A., Cheadle, W. G. Genetic background determines susceptibility during murine septic peritonitis. J. Surg. Res. 102, 45-49 (2002).
- Carchman, E. H., Rao, J., Loughran, P. A., Rosengart, M. R., Zuckerbraun, B. S. Heme oxygenase-1-mediated autophagy protects against hepatocyte cell death and hepatic injury from infection/sepsis in mice. Hepatology. 53, 2053-2062 (2011).
- Lo, S., et al. Lc3 over-expression improves survival and attenuates lung injury through increasing autophagosomal clearance in septic mice. Ann. Surg. 257, 352-363 (2013).
