Cecal ligatie en punctie-geïnduceerde Sepsis als een model om Autophagy studie bij muizen
Summary
Experimentele sepsis kan worden geïnduceerd in muizen met de blindedarm ligatie en punctie (CLP) methode. Voor deze protocollen autofagie in vivo beoordelen in het kader van CLP-geïnduceerde sepsis worden hier gepresenteerd: Een protocol voor het gebruik autofagie (GFP)-LC3 muizen, en een protocol voor autophagosome vorming van elektronenmicroscopie.
Abstract
Experimentele sepsis kan worden geïnduceerd in muizen met de blindedarm ligatie en punctie (CLP) methode, die polymicrobiële sepsis veroorzaakt. Hier wordt een protocol voorzien van sepsis van verschillende ernst induceren in muizen met de CLP techniek. Autophagy is een fundamentele weefsel reactie op stress en pathogeen invasie. Twee huidige protocollen om autofagie in vivo te beoordelen in het kader van experimentele sepsis worden hier ook gepresenteerd. (I) Transgene muizen die groene fluorescentie eiwit (GFP)-LC3 fusieproteïne onderworpen CLP. Gelokaliseerde verbetering van GFP signaal (puncta), zoals bepaald hetzij door immunohistochemische of confocale assays kunnen worden gebruikt om verbeterde autophagosome vorming detecteren en dus veranderde activatie van autofagie route. (II) Enhanced autophagic vacuole (autophagosome) formatie per eenheid weefsel gebied (als een marker van autofagie stimulatie) kan worden gekwantificeerd met behulp van elektronenmicroscopie. De studie van autophagic reacties op sepsis is een kritische compponent van het begrijpen van de mechanismen die weefsels reageren op infectie. Onderzoeksresultaten op dit gebied kan uiteindelijk bijdragen aan het begrijpen van de pathogenese van sepsis, die een groot probleem in de intensive care geneeskunde vertegenwoordigt.
Introduction
Sepsis, systemische inflammatoire respons op infectie, is een belangrijke doodsoorzaak bij kritisch zieke patiënten 1. Intra-abdominale infecties, vaak leidt tot polymicrobiële sepsis, goed voor 20% van sepsis, die aanzienlijke mortaliteit tot 60% 2 hebben. Met sepsis geassocieerde sterfte voornamelijk het gevolg is van multi-orgaanfalen met daaropvolgend orgaanfalen 3,4. Aanvullend onderzoek naar de pathogenese van deze ziekte is dringend nodig om de ontwikkeling van nieuwe en effectievere behandelingen bevorderen.
De methode cecal ligatie en punctie (CLP) is een veel gebruikte procedure voor het modelleren sepsis in vivo. Zoals de blindedarm is vol bacteriën, de punctie resultaten in polymicrobiële peritonitis, translocatie van bacteriën in het bloed (bacteriëmie), septische shock, multi-orgaanfalen en uiteindelijk de dood 5. Het is algemeen aanvaard dat CLP weerspiegelt de klinischerealiteit nauwkeuriger dan eerdere technieken, zoals injectie van endotoxine of gezuiverde bacteriën in knaagdieren, dus CLP wordt beschouwd als de gouden standaard (maar niet Onbeperkt) 6 voor de experimentele inductie en dus het onderzoek van de pathogenese van sepsis. In deze monografie, beschrijven we protocollen ontworpen om te beoordelen of pathogene mechanismen van sepsis omvatten autofagie.
Autofagie, een evolutionair geconserveerd cellulair proces, vergemakkelijkt de omzet van beschadigde eiwitten en organellen zoals mitochondriën en speelt een belangrijke rol in de klaring van intracellulaire pathogenen zoals bacteriën 7,8. Tijdens autofagie, worden cytosolische eiwitten of organellen afgezonderd in dubbele membraan gebonden blaasjes genoemd autofagosomen, die vervolgens worden geleverd aan de lysosomen voor degradatie 9. Een aantal eiwitten geïdentificeerd als zoogdierhomologen van autofagie genen (Atg)oorspronkelijk geïdentificeerd in gist, die het proces van autofagie regelen. De omzetting van microtubuli geassocieerde proteïne-1 lichte keten 3B (LC3B) (homoloog van Atg8) uit LC3B-I (vrije vorm) te LC3B-II (fosfatidylethanolamine-geconjugeerde vorm) vormt een belangrijke stap in autophagosome vorming 9. Autophagic dysfunctie wordt geassocieerd met ouder worden en menselijke ziekten, waaronder kanker en neurodegeneratieve aandoeningen 10. Bovendien autofagie beïnvloedt aangeboren en adaptieve immuniteit, zoals antigeen presentatie, lymfocyten ontwikkeling en cytokine secretie door immuuncellen 8. Zo lijkt het redelijk dat autofagie ook een rol zou kunnen spelen in de systemische inflammatoire respons op infectie (ic in sepsis).
Tot op heden verschillende methoden zijn beschreven om de rol van autofagie in weefselbeschadiging in vivo te beoordelen. Deze omvatten het gebruik van groene fluorescentie eiwit (GFP)-LC3 expressie muizen en kwantificering van autophagosomes in weefsel door elektronenmicroscopie (beide werkwijzen zijn in deze monografie). Aanvullende methoden omvatten de kwantificering van autophagic eiwitexpressie in weefselhomogenaten, en de analyse van autophagic flux (zoals elders beschreven) 11-13. Het doel van dit onderzoek is om de huidige protocollen voor de beoordeling van autofagie in vivo in het kader van experimentele sepsis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het grote voordeel van de CLP is dat het mogelijk onderzoekers sepsis van verschillende ernst onderzoeken (dat wil zeggen van low-tot mid-en high-grade). Ernst van geïnduceerde sepsis wordt beïnvloed door de lengte van blindedarm geligeerd (waarvan de belangrijkste determinant), de grootte van de naald gebruikt doorboren en het aantal openingen 15 uitgevoerd. Daarnaast kan de muizenstam en geslacht van invloed zijn op de ernst van sepsis; verschillende stammen zijn gevoeliger dan anderen en mannetj…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| GFP-LC3 Transgenic Mice | Riken (Japan) | RBRC00806 | GFP-LC3#53 |
| Xylazine | Henry-Schein | 568-0606 | Xylazine HCl Injection Vet |
| Ketamine | Henry-Schein | 995-2949 | Ketaset Inj 100 mg/ml |
| EtOH | Fisher | A405-20 | Histology Grade |
| EtOH | Fisher | A407-1 | For Sterilizatiion |
| silk surgical sutures 6-0 | Owens & Minor | 2300-0078OG, 017624 | |
| buprenorphine-HCl | Henry-Schein | 614-5157 | Buprenex Ampules |
| paraformaldehyde (37%) solution | JT Baker | S898-09 | |
| xylenes | Fisher | X3P-1GAL | |
| anti-GFP monoclonal antibody | Life Technologies | G10362 | |
| Hoescht | Sigma | 944403 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| OCT | VWR scientific | 25608-930 | |
| Sudan Black | Santa Cruz | sc-203760 | |
| EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate | Electron microscopy Sciences | 15960 | |
| propylene oxide | Sigma | 240397 | |
| Agar 100 resin | Agar scientific | R1045 | |
| dodecenylsuccinic anhydride | Sigma | 46346 | |
| methylnadic anhydride | Sigma | 45359 | |
| N-benzyldimethylamine | Sigma | 185582 |
References
- Hotchkiss, R. S., Karl, I. E. The pathology and treatment of sepsis. N. Engl. J. Med. 348, 138-150 (2003).
- Anaya, D. A., Nathens, A. B. Risk factors for severe sepsis in secondary peritonitis. Surg. Infect. 4, 355-362 (2003).
- Bone, R. C., Grodzin, C. J., Balk, R. A. Sepsis: A new hypothesis for pathogenesis of the disease process. Chest. 112, 235-243 (1997).
- Rivers, E., Med, s. h. o. c. k. .. N. .. E. n. g. l. .. J. .., et al. Early goal-directed therapy in the treatment of severe sepsis and septic shock. N. Engl. J. Med.. 345, 1368-1377 (2001).
- Deitch, E. A. Rodent models of intra-abdominal infection. Shock. 24 (Suppl 1), 19-23 (2005).
- Raven, K. Rodent models of sepsis found shockingly lacking. Nat. Med. 18, 998 (2012).
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132, 27-42 (2008).
- Virgin, H. W., Levine, B. Autophagy genes in immunity. Nat. Immunol. 10, 461-470 (2009).
- Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
- Choi, A. M., Ryter, S. W., Levine, B. Autophagy in human health and disease. N. Engl. J. Med. 368, 651-662 (2013).
- Haspel, J., et al. Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay. Autophagy. 7, 629-642 (2011).
- Chen, Z. H., et al. Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease. PLos One. 3, 3313 (2008).
- Kim, H. P., Chen, Z. H., Choi, A. M., Ryter, S. W. Analyzing autophagy in clinical tissues of lung and vascular diseases. Meth. Enzymol. 453, 197-216 (2009).
- Flierl, M. A., et al. Adverse functions of IL-17A in experimental sepsis. FASEB J. 22, 2198-2205 (2008).
- Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nat. Protoc. 4, 31-36 (2009).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140, 313-326 (2010).
- Wang, L., Ma, R., Flavell, R. A., Choi, M. E. Requirement of mitogen-activated protein kinase kinase 3 (MKK3) for activation of p38α and p38δ MAPK isoforms by TGF-β1 in murine mesangial cells. J. Biol. Chem. 277, 47257-47262 (2002).
- Ding, Y., Kim, J. K., Kim, S. I., Na, H. J., Jun, S. Y., Lee, S. J., Choi, M. E. TGF-{beta}1 protects against mesangial cell apoptosis via induction of autophagy. J Biol Chem. 285, 37909-37919 (2010).
- Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. Surgery. 94, 331-335 (1983).
- Godshall, C. J., Scott, M. J., Peyton, J. C., Gardner, S. A., Cheadle, W. G. Genetic background determines susceptibility during murine septic peritonitis. J. Surg. Res. 102, 45-49 (2002).
- Carchman, E. H., Rao, J., Loughran, P. A., Rosengart, M. R., Zuckerbraun, B. S. Heme oxygenase-1-mediated autophagy protects against hepatocyte cell death and hepatic injury from infection/sepsis in mice. Hepatology. 53, 2053-2062 (2011).
- Lo, S., et al. Lc3 over-expression improves survival and attenuates lung injury through increasing autophagosomal clearance in septic mice. Ann. Surg. 257, 352-363 (2013).
