Cecal ligadura e punção induzida Sepsis como um modelo para estudar a autofagia em Ratos
Summary
Sepse experimental pode ser induzida em camundongos usando a ligadura e punção do ceco método (CLP). Protocolos correntes para avaliar a autofagia in vivo no contexto de sepsia induzida por CLP são aqui apresentados: Um protocolo para medir autofagia utilizando ratinhos (GFP)-LC3, e um protocolo para medir a formação de autophagosome por microscopia electrónica.
Abstract
Sepse experimental pode ser induzida em camundongos usando a ligadura e punção do ceco método (CLP), que causa a sepse polimicrobiana. Aqui, um protocolo é fornecido para induzir sepsia de gravidade variável em ratinhos utilizando a técnica de CLP. A autofagia é uma resposta do tecido fundamental para o estresse ea invasão do patógeno. Dois protocolos correntes para avaliar a autofagia in vivo no contexto de sepsia experimental também são aqui apresentados. (I) camundongos transgênicos expressando a proteína fluorescente verde proteína de fusão (GFP)-LC3 são submetidos a CLP. Realce localizada do sinal GFP (puncta), tal como ensaiado ou com imuno-histoquímica ou confocal, pode ser utilizado para detectar a formação de autophagosome aumentado e, assim, a activação da via alterada autofagia. (II) aprimorado vacúolo autofágico (autophagosome) formação por área de tecido da unidade (como um marcador de estimulação autofagia) pode ser quantificado usando microscopia eletrônica. O estudo das respostas autofágicos a sepse é uma amostra críticaonent de compreensão dos mecanismos pelos quais os tecidos respondem à infecção. Os resultados da pesquisa nesta área pode vir a contribuir para a compreensão da patogênese da sepse, o que representa um grande problema em medicina intensiva.
Introduction
Sepse, uma resposta inflamatória sistêmica à infecção, representa uma das principais causas de morte em pacientes criticamente doentes 1. Infecções intra-abdominais, muitas vezes levando à sepse polimicrobiana, são responsáveis por 20% dos casos de sepse, que têm uma mortalidade significativa de até 60% 2. Mortalidade associada à sepse resulta principalmente de disfunção de múltiplos órgãos com falência de órgãos posterior 3,4. Investigações adicionais sobre o mecanismo patogênico da doença é urgentemente necessária para promover o desenvolvimento de novas terapias e mais eficazes.
O método de ligadura e perfuração cecal (CLP) é um procedimento comumente utilizado para sepse modelagem in vivo. Como o ceco é cheia de bactérias, os seus resultados de punção em peritonite polimicrobianas, a translocação de bactérias no sangue (bacteremia), choque séptico, disfunção de múltiplos órgãos e, em última análise, a morte 5. É geralmente aceite que a CLP reflete clínicarealidade com mais precisão do que as técnicas anteriores, como a injeção de endotoxina ou bactérias ainda purificadas em roedores, Assim, CLP é considerada o padrão-ouro (embora não sem limitações) 6 para a indução experimental e, portanto, a investigação da patogênese da sepse. Nesta monografia, descrevemos os protocolos destinados a avaliar se os mecanismos patogênicos de sepse incluem autofagia.
A autofagia, um processo celular evolutivamente conservada, facilita o volume de negócios de proteínas e organelas como as mitocôndrias danificadas e desempenha um papel importante na depuração de patógenos intracelulares incluindo bactérias 7,8. Durante a autofagia, proteínas ou organelas citosólicas são seqüestrados em vesículas ligadas à membrana dupla chamadas autofagossomas, que são posteriormente entregues aos lisossomos para degradação 9. Um número de proteínas foram identificadas como os seus homólogos de mamíferos de genes relacionados com a autofagia (ATG),originalmente identificado em leveduras, que regulam o processo de autofagia. A conversão de microtúbulos associados protein-1 cadeia leve 3B (LC3B) (homólogo de Atg8) a partir de-I LC3B (forma livre) para LC3B-II (forma fosfatidiletanolamina conjugado) representa um grande passo na formação autophagosome 9. Disfunção autofágica é associado com o envelhecimento e doenças humanas, incluindo câncer e doenças neurodegenerativas 10. Além disso, a autofagia afecta a imunidade inata e adaptativa, tais como apresentação de antigénio, o desenvolvimento de linfócitos e a secreção de citoquinas pelas células imunes 8. Assim, parece razoável que a autofagia pode também desempenhar um papel na resposta inflamatória sistémica à infecção (isto é, em sépsis).
Até à data, vários métodos têm sido descritos para avaliar o papel da autofagia em lesão de tecidos in vivo. Estes incluem o uso de proteína de fluorescência verde (GFP)-LC3 expressando camundongos ea quantificação de autophagosomes em tecidos por microscopia electrónica (estes dois métodos são descritos na presente monografia). Métodos adicionais incluem a quantificação da expressão da proteína autophagic em homogenatos de tecidos, e a análise de fluxo autophagic (como descrito noutro local) 11-13. O objetivo desta revisão é fornecer protocolos atuais para avaliar a autofagia in vivo, no contexto da sepse experimental.
Protocol
Representative Results
Discussion
A principal vantagem do CLP é que ele permite que os pesquisadores para investigar sepse de diferentes gravidades (ou seja, de baixo para médio e alto grau). A gravidade da sepsia induzida é afectada pelo comprimento do ceco ligado (que o determinante mais importante), o tamanho da agulha utilizado para punção e o número de orifícios 15 realizados. Além disso, a tensão do mouse e sexo podem ter impacto sobre a gravidade da sepse; várias cepas são mais suscetíveis do que outras e os homens…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| GFP-LC3 Transgenic Mice | Riken (Japan) | RBRC00806 | GFP-LC3#53 |
| Xylazine | Henry-Schein | 568-0606 | Xylazine HCl Injection Vet |
| Ketamine | Henry-Schein | 995-2949 | Ketaset Inj 100 mg/ml |
| EtOH | Fisher | A405-20 | Histology Grade |
| EtOH | Fisher | A407-1 | For Sterilizatiion |
| silk surgical sutures 6-0 | Owens & Minor | 2300-0078OG, 017624 | |
| buprenorphine-HCl | Henry-Schein | 614-5157 | Buprenex Ampules |
| paraformaldehyde (37%) solution | JT Baker | S898-09 | |
| xylenes | Fisher | X3P-1GAL | |
| anti-GFP monoclonal antibody | Life Technologies | G10362 | |
| Hoescht | Sigma | 944403 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| OCT | VWR scientific | 25608-930 | |
| Sudan Black | Santa Cruz | sc-203760 | |
| EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate | Electron microscopy Sciences | 15960 | |
| propylene oxide | Sigma | 240397 | |
| Agar 100 resin | Agar scientific | R1045 | |
| dodecenylsuccinic anhydride | Sigma | 46346 | |
| methylnadic anhydride | Sigma | 45359 | |
| N-benzyldimethylamine | Sigma | 185582 |
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