Registrazione elettrofisiologica nel cervello di intatto Zebrafish adulti
Summary
Questo documento descrive come un zebrafish adulto può essere immobilizzata, intubato, e utilizzati per esperimenti di elettrofisiologia in vivo per permettere registrazioni e manipolazione di attività neurale in un animale intatto.
Abstract
In precedenza, studi elettrofisiologici in zebrafish adulto si sono limitati a tagliare i preparativi o alle preparazioni oculare e registrazioni electrorentinogram. Questo documento descrive come un zebrafish adulto può essere immobilizzata, intubato, e utilizzati per esperimenti di elettrofisiologia in vivo, che permette la registrazione di attività neurale. Immobilizzazione dell'adulto richiede un meccanismo per fornire ossigeno disciolto alle branchie al posto di movimento buccale e opercolare. Con la nostra tecnica, gli animali vengono immobilizzati e perfusi con acqua habitat per soddisfare questo requisito. Una craniotomia viene eseguita sotto tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anestesia per fornire l'accesso al cervello. L'elettrodo primario viene quindi posizionato all'interno della finestra craniotomia per registrare l'attività cerebrale extracellulare. Attraverso l'uso di un sistema di perfusione multitube, una varietà di composti farmacologici può essere somministrato ai pesci adulti e eventuali alterazioni nell'attività neuralepuò essere osservato. La metodologia permette non solo per le osservazioni devono essere fatte per quanto riguarda i cambiamenti di attività neurologica, ma permette anche di effettuare confronti tra larvale e zebrafish adulto. Questo dà ricercatori la capacità di identificare le alterazioni dell'attività neurologica dovuta all'introduzione di vari composti a differenti stadi di vita.
Introduction
In questo articolo, un protocollo è descritto per ottenere le registrazioni in vivo di attività neurale in zebrafish adulto. Metodi di registrazione extracellulari sono utilizzati, fornendo misure di tensione di attività elettrica all'interno di una piccola regione del tessuto neurale. Questo metodo di indagine comporta monitorare un gran numero di cellule in un animale comportarsi 1. In precedenza, le registrazioni fetta sono stati effettuati sia negli adulti e larve, come hanno fatto i preparativi oculare e registrazioni elettroretinogramma. Questi esperimenti sono stati eseguiti in gran parte al dettaglio risposte fisiologiche dei vari sistemi sensoriali 2-5. Fino a poco tempo, preparazioni cerebrali intatti sono stati disponibili per eseguire elettrofisiologia con zebrafish 3,6,7 larva, dove la respirazione e ossigeno diffusione può avvenire attraverso la pelle solo. La nostra preparazione consente l'attività neurologica nativo di zebrafish adulto da misurare, mentre l'animale rimane pienamente cosciente e consapevole of dintorni.
Zebrafish (Danio rerio) attualmente gioca un ruolo fondamentale come modello per studi genetici, tossicologici, farmacologici e fisiopatologici 3. Zebrafish hanno guadagnato visibilità all'interno del campo delle neuroscienze perché condividono ampia omologia con i mammiferi a livello genetico, nervosi ed endocrini livelli 8. Negli ultimi dieci anni, sono state utilizzate tecniche di neuroanatomici e immunoistochimica standard per determinare l'organizzazione caratteristici dettagliata del sistema nervoso zebrafish 9-12 e della distribuzione di diversi neurotrasmettitori 3,8,13. Più di recente, i ricercatori hanno spostato la loro attenzione per studi funzionali 14,15, molti dei quali si incentrano sui processi comportamentali 16-19 e le caratteristiche elettrofisiologiche dei sistemi sensoriali 2,13,20. Un piccolo numero di questi studi si sono concentrati sull'attività elettrica di specifiche aree del adult cervello zebrafish 21-23, ma non sono stati eseguiti utilizzando un approccio in vivo.
Questo protocollo può essere adattato per studi elettrofisiologici sia attività spontanea ed evocata all'interno del sistema nervoso zebrafish per descrivere i modelli di attività in specifiche regioni cerebrali. L'uso di questa tecnica permette di effettuare confronti tra l'attività neurologica dei giovani stadi larvali e adulti. Inoltre, il nostro protocollo consente confronti tra alterazioni genetiche o farmacologici. Insieme ad altri approcci, come l'ingegneria genetica o prove farmacologiche, questo metodo offre una nuova possibilità per l'analisi funzionale di comunicazione neuronale e la plasticità nel intatta animali adulti, nonché per potenziali applicazioni, come studiare epilessia insorgenza tardiva o processi neurodegenerativi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo è stato utilizzato per misurare l'attività neurale di zebrafish adulti in vivo. Con la pratica, l'attività neurale può essere osservato in modo coerente, anche se le caratteristiche (ampiezza e forma degli eventi) dell'attività registrata possono variare tra individui. L'utilizzo della tecnica di registrazione extracellulare può spiegare questa osservazione. Il metodo fornisce il monitoraggio simultaneo di un numero elevato di celle all'interno di una regione 1,<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH / NINDS di Grant R01NS070159 (a TMD, JDL e ATS).
Materials
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2750HC | Dilute 100% to 70% with DI water |
| 2 M Potassium Chloride | J.T. Baker | ||
| 2 M Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| 0.4% Tris-Buffered Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | pH 7.2-7.4; stored at -20 oC |
| Pancuronium Bromide | Sigma-Aldrich | P1918 | Diluted to 1 μg/μl in 1x phosphate buffered saline |
| Habitat water | pH 7.0-7.4, conductivity of 400-450 μS; maintained by Instant Ocean and Sodium Bicarbonate | ||
| Pentylenetetrazol | Sigma-Aldrich | P6500 | Diluted to 300 mM in 1x phosphate buffered saline |
| Nanofil syringe | World Precision Instruments, Inc. | 06A | |
| 34 G Beveled needle | World Precision Instruments, Inc. | NF34BV | |
| Sponge | Small pore and chemical-free | ||
| Foam-backed fine sand paper | 5 x 5 cm2 is large enough | ||
| 9 V Battery | |||
| Wires with alligator clips | Need 2 | ||
| 37 cm x 42 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KEM | |
| 11 cm x 21 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KWP | |
| 1/8 in diameter tube | |||
| 1 cm diameter tube | |||
| 1 mm diameter tube | |||
| Reducing valve with female Luer lock cap and silicone ferrule | Qosina | 51505 | |
| Microscope (Leica MZ APO) | Another microscope can be used | ||
| Vanna scissors | Roboz Surgical Instruments Co., Inc. | 15018-10 | |
| 60 ml Luer lock syringe tubes | Becton, Dickinson and Company | 309653 | |
| 3-way Stopcocks with Luer connections | |||
| 1-way Stopcock with Luer connection | |||
| Fisherbrand 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | NC9299146 | |
| Fisherbrand 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | S67961 | |
| 4 in Borosilicate capillary tube | World Precision Instruments | TW100F-4 | Can contain a filament to aid in filling with solution |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Digidata 1440 | Molecular Devices | ||
| Axon Aloclamp 900A | Molecular Devices | ||
| Axoclamp software | Molecular Devices | ||
| HS-9Ax 1U headstage | Molecular Devices | ||
| 0.010 in Silver wire | A-M Systems, Inc. | ||
| Q-series electrode holder | Warner Instruments | QSW-A10P | |
| 10 ml Luer lock syringe | |||
| 1 mm x 15 in Tubing | Connect Luer lock syringe to Q-series electrode holder | ||
| Micromanipulator | Warner Instruments | Need 2 | |
| Microsoft-based PC | Dell | ||
| Faraday Cage | |||
| Air Table | |||
| Dissecting Microscope |
References
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