In-vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie einzelner Nervenenden in der Haut
Summary
Das Protokoll für die dynamische Längs Bildgebung und Selective Laser Läsion des Nervenenden in Reporter-transgenen Mäusen wird vorgestellt.
Abstract
Nervenenden in der Haut sind in physiologischen Prozessen wie Abfühlen 1 als auch in pathologischen Prozessen, wie neuropathischem Schmerz 2 beteiligt. Ihre enge-Boden-Positionierung erleichtert mikroskopischen Abbildung von Hautnervenenden in lebenden intakten Tier. Mit Multiphotonen-Mikroskopie ist es möglich, feine Bilder Überwindung des Problems der starken Lichtstreuung des Hautgewebes zu erhalten. Reporter transgenen Mäusen, die EYFP unter der Kontrolle der Thy-1-Promotor in Neuronen (einschließlich Peripherie sensorischen Neuronen) exprimieren, sind für die Längsschnittstudien von einzelnen Nervenenden über längere Zeit gut geeignet bis zu mehreren Monaten oder sogar lebenslang. Außerdem wurde unter Verwendung der gleichen Femtosekundenlaser für die Bildverarbeitung, ist es möglich, hochselektive Läsionen der Nervenfasern für die Studien der Nervenfaser Umstrukturierung erzeugen. Hier, in-vivo-Bildgebung stellen wir ein einfaches und zuverlässiges Protokoll für Mehrphotonen und Längslaserbasierte Mikrochirurgie auf der Haut von Mäusen Nervenenden.
Introduction
Kutanen Nervenenden unterziehen dynamischen Veränderungen unter verschiedenen pathophysiologischen Zuständen. Nervenfasern können durch den Prozess der Degeneration und Regeneration oder Umstrukturierung im Zuge von Krankheiten wie periphere Neuropathie 2 oder Morton-Neurom 3 gehen. Nach einer traumatischen Verletzung, ein wichtiger Bestandteil der Nervenenden in der Haut ist Dynamik reinnervation des beschädigten Bereichs. , Ist der gemeinsame Ansatz zur Untersuchung von Nervenenden jedoch ex vivo histologische Schnitte, die Echtzeit-Informationen über die laufenden Prozesse 4 fehlt. Verwendung genetisch kodierte Fluoreszenzmarker, ist es möglich, die Nervenenden in der Haut von lebenden Tieren zu verfolgen, wodurch man reich und deutlich mehr relevante Informationen über die strukturellen Veränderungen. Die Untersuchung der kutanen Nervenenden ist möglich mit herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie jedoch die starke Lichtstreuung des Hautgewebes stark untergräbt die Qualitätder Daten erworben 5. Multiphotonenmikroskopie ermöglicht die Erfassung von Bildern mit hoher Auflösung in den stark streuenden Gewebe durch die nicht-lineare Summierung der Energie der Anregungslichtphotonen was zur Emission von Fluoreszenz nur von dem Brennpunkt des Objektivs. Dieser Effekt führt zu einer robusten Zunahme der Eindringtiefe und die Verbesserung des Signal-zu-Rausch-Verhältnis bei der Messung der Hautgewebe 6. Unter Verwendung des gleichen Lasers, wie für die Bildgebung, ist es möglich, eine selektive Zerlegung der Nervenfasern 7 herzustellen. In dem folgenden Protokoll zeigen wir die Methode der Längs Imaging von Hautnervenenden in vivo in transgenen Mäusen Reporter kombiniert mit selektiven Laser-Läsion mit kommerziell erhältlichen Multiphotonen-Mikroskop-System.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Video zeigen wir die Protokoll-Methode zur nicht-invasiven Längs Zwei-Photonen-Imaging von einzelnen Nervenenden.
Die Dynamik der Haut Innervationen in Krankheiten wie Psoriasis und periphere Neuropathie 2, und in traumatischen Verletzungen 9 betroffen. Zwei-Photonen-Bildgebung ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der Nervenfasern Strukturen Kollagenmatrix. Die Verwendung von transgenen Mäusen Reporter hilft, die Probleme der Färbung der Nervenfasern …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Neurotar AG für technische Hilfe, CIMO Stiftung und FGSN für die finanzielle Unterstützung bedanken.
Materials
| Round cover glass | Electron Microscopy Science | 72296-05 | 5 mm diameter #1.5 thickness |
| Eye drops Viscotears | Novartis | 2mg/g | |
| Superglue Loctite 401 | Henkel | 135429 | |
| Ketaminol | Intervet | Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gramm of animal weight) | |
| Rompun | Bayer Healthcare | Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gramm of animal weight) | |
| Working solution is a mixture of Ketamine 10 mg/ml and Xylazine 1.25 mg/ml in PBS | |||
| Ethanol 70% | |||
| Distilled water or Milli-Q water | |||
| Syringes 1ml | BD | 300013 | |
| 30G 1/2" needles | BD | 304000 | |
| Plastic packaging material | Could be purchaized from general hardware store | ||
| FV-1000MPE microscope | Olympus | FV-1000MPE | Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation |
| 25X XLPlan objective | Olympus | XLPLN 25XWMP | Water imersion objective optimized for multiphoton imaging |
| Mai-Tai DeepSee laser (2W) | SpectraPhysics | ||
| Heating pad | Supertech | TMP-5b | Heating pad with a temperature controller |
| Metal ring fixator | Neurotar Ltd. | ||
| ImageJ | NIH | Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| Thy1-YFPH mice strain | JaxLab | 003782 |
References
- Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. Mechanisms of sensory transduction in the skin. Nature. 445, 858-865 (2007).
- Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
- Wu, K. K. Morton’s interdigital neuroma: a clinical review of its etiology, treatment, and results. J. Foot Ankle Surg. 35, 112-119 (1996).
- Lauria, G., Lombardi, R. Skin biopsy: a new tool for diagnosing peripheral neuropathy. BMJ. 334, 1159-1162 (2007).
- Cheng, C., Guo, G. F., Martinez, J. A., Singh, V., Zochodne, D. W. Dynamic plasticity of axons within a cutaneous milieu. J. Neurosci. 30, 14735-14744 (2010).
- Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo. J Vis Exp. (46), e2062 (2010).
- Sacconi, L., O’Connor, R. P., Jasaitis, A., Masi, A., Buffelli, M., Pavone, F. S. In vivo multiphoton nanosurgery of cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502 (2007).
- Robinson, L. R. Traumatic injury to peripheral nerves. Muscle Nerve. 23, 863-873 (2000).
- Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Marinkovic, P., Reuter, M. S., Brill, M. S., Godinho, L., Kerschensteiner, M., Misgeld, T. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 4296-4301 (2012).
- Amit, S., Yaron, A. Novel systems for in vivo monitoring and microenvironmental investigations of diabetic neuropathy in a murine model. J Neural Transm. 119, 1317-1325 (2012).
- Yu, H., Fischer, G., Jia, G., Reiser, J., Park, F., Hogan, Q. H. Lentiviral gene transfer into the dorsal root ganglion of adult rats. Mol Pain. 7, 63 (2011).
- Yuryev, M., Khiroug, L. Dynamic longitudinal investigation of individual nerve endings in the skin of anesthetized mice using in vivo two-photon microscopy. J Biomed Opt. 17, 046007 (2012).
