בVivo שני פוטונים מיקרוסקופית של קצות עצבים בודדים בעור
Summary
הפרוטוקול להדמיה אורך דינמית ונגע לייזר סלקטיבית של קצות עצבים בעכברים מהונדסים כתב מוצג.
Abstract
קצות עצבים בעור מעורבים בתהליכים פיסיולוגיים כגון חישת 1, כמו גם בתהליכים פתולוגיים כגון כאב נוירופתי 2. המיקום קרוב לפני השטח שלהם מאפשר הדמיה מיקרוסקופית של קצות עצבים בעור בחיים של בעלי חיים בשלמותה. באמצעות מיקרוסקופ multiphoton, זה אפשרי כדי להשיג תמונות משובחות להתגבר על הבעיה של פיזור אור החזק של רקמת העור. עכברים הטרנסגניים כתב שמבטאים EYFP תחת השליטה של אמרגן Thy-1 בתאי עצב (כולל פריפריה עצב סנסורי) הם גם מתאימים למחקרים ארוכי הטווח של קצות עצבים בודדים על פני תקופות זמן ארוכות עד מספר חודשים או אפילו לכל חיים. יתר על כן, שימוש באותו הלייזר femtosecond כלהדמיה, ניתן לייצר נגעים סלקטיבית מאוד של סיבי עצב למחקרים של הארגון מחדש סיבי עצב. כאן, אנו מציגים פרוטוקול פשוט ואמין לmultiphoton אורך בתחום ההדמיה vivo ומייקרו מבוסס לייזר על קצות עצבים בעור עכבר.
Introduction
קצות עצבים עורית עוברים שינויים הדינמיים במדינות pathophysiological שונות. סיבי עצב יכולים לעבור את התהליך של ניוון והתחדשות או ארגון מחדש בקורס של מחלות כגון נוירופתיה היקפית 2 או מורטון נוירומה של 3. לאחר פציעה טראומטית, חלק חשוב מדינמיקת קצות עצבים בעור הוא עצבוב של האזור הפגוע. עם זאת, הגישה המקובלת לחקירה של קצות עצבים היא vivo לשעבר חתך היסטולוגית שחסרי מידע בזמן אמת על התהליכים המתמשכים 4. באמצעות סמני ניאון מקודדים גנטיים, ניתן לעקוב אחר קצות עצבים בעור של בעלי חיים, וכך להשיג מידע עשיר ומשמעותי יותר רלוונטי בשינויים המבניים. החקירה של קצות עצבים עורית אפשרית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הקונבנציונלי, לעומת זאת, פיזור האור החזק של רקמת העור חזק פוגע באיכותשל נתונים שנרכשו 5. מיקרוסקופיה multiphoton מאפשרת רכישה של תמונות ברזולוציה גבוהה ברקמות מאוד הפיזור בשל הסיכום שאינו ליניארי של אנרגיה של פוטונים אור העירור וכתוצאה מכך הפליטה של הקרינה רק מנקודת האובייקטיבית מוקדי. השפעה זו מובילה לעלייה חזקה בעומק החדירה ושיפור של יחס אות לרעש למדידה ברקמות עור 6. באמצעות אותו הלייזר כמו הדמיה, ניתן לייצר לנתיחה סלקטיבית של סיבי עצב 7. בפרוטוקול הבא מציגים את השיטה של הדמיה האורך של קצות עצבים עורית in vivo בעכברים מהונדסים כתב בשילוב עם נגע לייזר סלקטיבי באמצעות מערכת מיקרוסקופ multiphoton זמינה מסחרי.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול וידאו זה אנו מדגימים את השיטה להדמית שני פוטונים אורך לא פולשנית של קצות עצבים בודדים.
הדינמיקה של עצבוב עור מושפעת במחלות כגון פסוריאזיס ונוירופתיה היקפית 2, ובפציעות טראומטיות 9. שני פוטונים הדמיה מאפשרת נ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לNeurotar בע"מ לקבלת סיוע טכני, CIMO קרן וFGSN לתמיכה כספית.
Materials
| Round cover glass | Electron Microscopy Science | 72296-05 | 5 mm diameter #1.5 thickness |
| Eye drops Viscotears | Novartis | 2mg/g | |
| Superglue Loctite 401 | Henkel | 135429 | |
| Ketaminol | Intervet | Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gramm of animal weight) | |
| Rompun | Bayer Healthcare | Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gramm of animal weight) | |
| Working solution is a mixture of Ketamine 10 mg/ml and Xylazine 1.25 mg/ml in PBS | |||
| Ethanol 70% | |||
| Distilled water or Milli-Q water | |||
| Syringes 1ml | BD | 300013 | |
| 30G 1/2" needles | BD | 304000 | |
| Plastic packaging material | Could be purchaized from general hardware store | ||
| FV-1000MPE microscope | Olympus | FV-1000MPE | Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation |
| 25X XLPlan objective | Olympus | XLPLN 25XWMP | Water imersion objective optimized for multiphoton imaging |
| Mai-Tai DeepSee laser (2W) | SpectraPhysics | ||
| Heating pad | Supertech | TMP-5b | Heating pad with a temperature controller |
| Metal ring fixator | Neurotar Ltd. | ||
| ImageJ | NIH | Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| Thy1-YFPH mice strain | JaxLab | 003782 |
References
- Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. Mechanisms of sensory transduction in the skin. Nature. 445, 858-865 (2007).
- Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
- Wu, K. K. Morton’s interdigital neuroma: a clinical review of its etiology, treatment, and results. J. Foot Ankle Surg. 35, 112-119 (1996).
- Lauria, G., Lombardi, R. Skin biopsy: a new tool for diagnosing peripheral neuropathy. BMJ. 334, 1159-1162 (2007).
- Cheng, C., Guo, G. F., Martinez, J. A., Singh, V., Zochodne, D. W. Dynamic plasticity of axons within a cutaneous milieu. J. Neurosci. 30, 14735-14744 (2010).
- Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo. J Vis Exp. (46), e2062 (2010).
- Sacconi, L., O’Connor, R. P., Jasaitis, A., Masi, A., Buffelli, M., Pavone, F. S. In vivo multiphoton nanosurgery of cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502 (2007).
- Robinson, L. R. Traumatic injury to peripheral nerves. Muscle Nerve. 23, 863-873 (2000).
- Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Marinkovic, P., Reuter, M. S., Brill, M. S., Godinho, L., Kerschensteiner, M., Misgeld, T. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 4296-4301 (2012).
- Amit, S., Yaron, A. Novel systems for in vivo monitoring and microenvironmental investigations of diabetic neuropathy in a murine model. J Neural Transm. 119, 1317-1325 (2012).
- Yu, H., Fischer, G., Jia, G., Reiser, J., Park, F., Hogan, Q. H. Lentiviral gene transfer into the dorsal root ganglion of adult rats. Mol Pain. 7, 63 (2011).
- Yuryev, M., Khiroug, L. Dynamic longitudinal investigation of individual nerve endings in the skin of anesthetized mice using in vivo two-photon microscopy. J Biomed Opt. 17, 046007 (2012).
