JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bio-ingénierie

Met behulp van Microfluidics Chips voor Live Imaging en Studie van Injury Reacties in<em> Drosophila</em> Larven

Published: February 07, 2014
doi:
10.3791/50998
, , , , , , ,
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology,University of Michigan, 2Department of Biomedical Engineering,University of Michigan, 3Life Sciences Institute,University of Michigan, 4Department of Cell and Developmental Biology,University of Michigan, 5Department of Mechanical Engineering,University of Michigan

Summary

Drosophila larven zijn een aantrekkelijk model systeem voor live-imaging vanwege hun doorschijnende cuticula en krachtige genetica. Dit protocol beschrijft hoe u een single-layer PDMS apparaat, genaamd de 'larve chip' voor live-beeldvorming van cellulaire processen binnen neuronen van 3 e instar Drosophila larven benutten.

Abstract

Live-beeldvorming is een belangrijke techniek voor het bestuderen celbiologische processen, maar dit kan een uitdaging in levende dieren. De doorschijnende cuticula van de Drosophila larve maakt het een aantrekkelijke modelorganisme voor live-imaging studies. Echter, een belangrijke uitdaging voor live-imaging technieken is om niet-invasief te immobiliseren en de positie van een dier op het microscoop. Dit protocol biedt een eenvoudige en makkelijk te gebruiken methode voor het immobiliseren en beeldvorming Drosophila larven op een polydimethylsiloxaan (PDMS) microfluïdische apparaat, dat noemen we de 'larve chip'. De larve chip bestaat uit een gezellige-passende PDMS microkamer dat een dunne glazen dekglaasje, die, op verzoek van een vacuüm via een spuit, immobiliseert het dier en brengt ventrale structuren zoals de zenuw koord, segmentale zenuwen, en het lichaam wordt bevestigd muur spieren, in de nabijheid van het dekglaasje. Dit zorgt voor een hoge resolutie imaging, en belangrijker nog, vermijdt het gebruik van anesthetics en chemicaliën, die het onderzoek van een groot aantal fysiologische processen vergemakkelijkt. Aangezien larven herstellen gemakkelijk van de immobilisatie kunnen ze gemakkelijk worden veelvuldige beeldvorming sessies. Dit zorgt voor longitudinale studies over de tijd cursussen, variërend van uren tot dagen. Dit protocol beschrijft stap voor stap hoe u de chip en hoe de chip voor live-imaging van neuronale gebeurtenissen in larven 3 e instar benutten bereiden. Deze gebeurtenissen zijn het snelle transport van organellen in axonen, calcium reacties op letsel, en time-lapse-studies van de handel in foto-converteerbare eiwitten over lange afstanden en tijdschalen. Een andere toepassing van de chip is om regeneratieve en degeneratieve reacties op axonalverwonding bestuderen, zodat het tweede deel van dit protocol beschrijft een nieuwe en eenvoudige procedure voor het verwonden van axonen binnen perifere zenuwen door een segmentale zenuw crush.

Introduction

De fruitvlieg, Drosophila melanogaster, is gebruikt als modelorganisme voor meer dan 100 jaar, en is behulpzaam geweest bij het ​​definiëren fundamentele signalering en ontwikkelingstrajecten die geconserveerd van ongewervelde menselijke bewezen. Live-beeldvorming is een belangrijke benadering van het bestuderen van cellulaire mechanismen, en de eenvoudige bouwplan en doorschijnende cuticula van de Drosophila larve maakt het een aantrekkelijk systeem voor live-imaging, met name omdat er veel genetische tools beschikbaar voor het uitdrukken van fluorescent gelabelde eiwitten in specifieke celtypen.

Een belangrijke uitdaging voor live-imaging technieken is om niet-invasief te immobiliseren en de positie van een dier voor microscopie. Conventionele benaderingen omvatten immobilisatie dissectie 1,2 of gebruik van chloroform, beide doden dier. De verdovingsmiddelen ether 4 en isofluorane 5-8 zijn ook gebruikt. Terwijl anesthetica bieden veel voordelen, Ze neurale activiteit en belangrijke fysiologie (inclusief de hartslag) 9-11 remmen ook, dus kan het proces bestudeerd beïnvloeden en stress creëren op het dier. Er zijn ook menselijke bezorgdheid over de veiligheid voor het werken met ether en isofluorane.

We hebben een drugsvrije methode om Drosophila larven te immobiliseren in een enkele laag PDMS microfluïdische apparaat, dat noemen we de 'larve chip' 12 ontwikkeld. Dit protocol beschrijft hoe inwinnen of de larve chip, en hoe deze te gebruiken voor live-imaging in larven 3 e instar vroeg-geënsceneerd. De chip bestaat uit een-gezellige-passende microkamer, die, op verzoek van een vacuüm via een spuit, immobiliseert het dier via zachte mechanische kracht. De immobilisatie methode brengt ventrale structuren zoals de zenuw koord, segmentale zenuwen, en het lichaam muur spieren, in de nabijheid van een glazen dekglaasje. Dit zorgt voor een hoge resolutie afbeelding van dergelijke structuren met hoge numerieke apertuur (hoge vergroting) doelstellingen.

Voordelen van de larve chip opzichte van andere conventionele technieken omvatten de volgende: (i) gebruik van de larve chip vervangt het gebruik van chemische stoffen, waardoor in vivo beeldvorming van niet-verdoofde dieren. (Ii) Larven herstellen direct na vrijlating uit de chip (in tegenstelling tot een 2 uur herstelperiode voor isofluorane 8,13). Dit zorgt voor beeldvorming in brede tijdschalen, variërend van milliseconden tot enkele minuten, uren en dagen. (Iii) het gebruik van PDMS, een gasdoorlatend materiaal zorgt voor continue diffusie van zuurstof / lucht uit de omgeving in de larve lichaam. (Iv) De chip is makkelijk en veilig te gebruiken, en (v) het is herbruikbaar en kan worden vervaardigd tegen minimale kosten.

Naast de gebruiksaanwijzing van de larve chip, dit protocol enkele voorbeelden van het gebruik studeren neuronale gebeurtenissen in 3e instar larven geven. Deze omvatten live-beeldvorming van Axonal transport, calcium reacties op letsel, en time-lapse-studies van de handel in foto-converteerbare eiwitten over lange afstanden en tijdschalen.

Een andere toepassing van de chip neuronale reacties op axonalverwonding bestuderen. Hiervoor is een extra procedure is beschreven (in deel 3) voor het verwonden van axonen binnen perifere zenuwen door een segmentale zenuw crush. Deze eenvoudige bepaling kan zowel snel en reproduceerbaar uitgevoerd onder standaard ontleding stereomicroscoop, die zorgt voor veel dieren tegelijk te verwerken. Cellulaire reacties op de schade kan worden bestudeerd door live-imaging in de larve chip.

Protocol

1. Het maken van de PDMS Chip Om een ​​PDMS chip van de SU-8 mal te maken, volg dan de stappen 1,1-1,7. Als een chip is bij de hand, maar moet samengesteld voor gebruik, doorgaan naar stap 1.8. Meng 45 g van PDMS basis en 4,5 g van de verharder (10:1 ratio) van een PDMS-kit in een kleine wegwerp plastic container en meng ze grondig met behulp van een plastic roerstokje. Zet het vat in een vacuüm verpakking (bijvoorbeeld een exsiccator) gedurende 10 min om eventuele luchtbellen te verwijderen. Plaats de SU-8 mal de bodem van een 150 mm diameter plastic schaaltje en giet langzaam de PDMS mengsel in de mal. Zorg dat er geen luchtbellen te genereren tijdens het gieten van PDMS. Hard de PDMS in een oven (of incubator) bij 650 ° C gedurende 4 uur. Verwijder de uitgeharde PDMS/SU-8 mal uit de oven en laat het afkoelen voor een paar minuten. Met behulp van een scheermesje, snijd de uitgeharde PDMS langs de rand van de SU-8 schimmel en verwijdert u deze en SU-8 mal. Verdeel de PDMS plaatin afzonderlijke PDMS chips met een scheermesje. Met behulp van een 21 G naald afgeven, prik een gat in de vacuümpoort (weergegeven in figuur 1A) van het PDMS chip. Neem een ​​23 G doseernaald en draai de naald van de sokkel een paar keer om de naald breken tippen van de sluis hub. Steek de 23 G naald in een klein stukje van de polyethyleen buis, zodat de buis omvat tenminste een millimeter van de naald. Maak dan gebruik van een scheermesje om uit de buurt van de naald knip het teveel aan slangen. Dit creëert een plastic ring rond een uiteinde van de naald, die een afdichting creëert wanneer ze in het vacuüm inlaatkanaal. Voor gebruik met een omgekeerde microscoop (figuur 1B en 2A-B): steek de 23 G naald in het gat van de vacuüm-poort. Voor gebruik met een rechtopstaande microscoop (figuren 1C en 2C-D): Por tweede gat aan de zijkant van de PDMS chip met een 21 G Vervennsing naald; dit gat zal de toegang tot het eerste gat vanaf de zijkant voorzien. Steek vervolgens de 23 G naald met slang ring in de zijkant gat. Leg een stuk dubbelzijdig plakband over de bovenkant van de PDMS chip om het bovenste gat (figuur 1C) te dichten. Neem een ​​stuk polyethyleen buis die ongeveer 20 cm lang. Sluit het ene uiteinde van de slang aan de naaldpunt dat in het vacuüm-poort wordt geplaatst. Sluit de andere kant van de slang aan op een van de poorten van een 3-weg klep (zie '3-weg kraan 'in de lijst van materialen) Bevestig een injectiespuit 20 ml in een van de twee overgebleven poorten. De laatste poort is open voor het milieu. 2. Met behulp van de Larve Chip voor Live Imaging Reinig de PDMS chip met doorzichtig plakband. Bevestig een stukje tape aan de onderkant van de chip. Zorg ervoor dat de tape wordt het gehele PDMS oppervlak aan te raken, en trek het tape. Herhaal de bovenstaande stap 2-3x te zorgen dat er tegeen deeltjes of olie (overgedragen van eerdere experimenten) op het oppervlak van de chip PDMS. Omdat de PDMS chip herbruikbaar, is het zeer belangrijk om olieresten verwijderen omdat de hechting van PDMS kunnen beïnvloeden glazen en resulteren in onvoldoende afdichting. Transfer vroeg (dwz foerageergebied) larven 3 e instar een petrischaal met water. (Het voederen 3e instar larven in het voedsel, in plaats van de kant van de cultuur flacon). Baad de larven in het water om kweekmedium te verwijderen. Neem een ​​schone glazen dekglaasje en plaats een kleine druppel Halocarbon 700 olie in het centrum. Met behulp van een tang, voorzichtig pick-up een schone, vroeg-geënsceneerde larve 3 e instar van het water (de larve moet ~ 3,5-4 mm lang zijn). Plaats het dier even op een lichtgewicht doekje of papieren handdoek om het overtollige water te verwijderen en plaats het op de olie druppel. De druppel moet klein genoeg zodat de luchtpijp van de larven niet gecoat zijn. Laat de larve stay op Oliedruppelsnelheid voor 10 sec. Verwijder de larve uit de olie te laten vallen en plaats het op een schoon glas dekglaasje. Breng de larve naar een andere schone glazen dekglaasje. Deze stap verwijdert overtollige olie. Besteed aandacht aan larve oriëntatie. Voor de beeldvorming van de neurale snoer en segmentale zenuwen, moet de buikzijde van larve zitten op het dekglaasje. De dorsale zijde, gekenmerkt door twee longitudinale tracheale buizen, moet naar boven wijzen. Let op: dit is de oriëntatie van de larve natuurlijk de voorkeur. Plaats voorzichtig de PDMS-chip op de top van de larve. De larve worden afgestemd op centrum midden van de microkamer, met zijn staart gericht op de vacuüm poort. Zorg ervoor dat de larve niet de randen van de kamer raken. Dit is vooral belangrijk voor de anterieure en posterieure tracheale terminals. Opmerking: deze stap wordt best gedaan onder een stereomicroscoop. Duw de PDMS chip tegen het glas dekglaasje om een ​​goede afdichting te bereiken. Zorg ervoor dat de larve geheelomsloten door de microkamer wanneer de PDMS chip wordt het aanraken van de glazen dekglaasje. Zet de 3-weg-klep, zodat de spuit lucht kan trekken uit de PDMS microkamer (door de slang) om een ​​vacuüm te creëren. Met een hand de PDMS chip / glas dekglaasje stevig. Gebruik de andere hand om de zuiger te trekken. Trekken 2-2,5 ml lucht, totdat de weerstand wordt gevoeld in de spuit handvat, om vacuüm te creëren. Het vacuüm veroorzaakt een afdichting tussen de PDMS chip, olie en dekglaasje interfaces en beperkt de mobiliteit van de larve. Schakel de klep af zodat de PDMS chip wordt geïsoleerd uit de injectiespuit en uit de omgeving. Hierdoor wordt een relatief stabiele vacuümniveau gehandhaafd in de microkamer zonder dat de spuit plunjer. Controleer de larve onder de stereoscoop om ervoor te zorgen dat het hele dier lichaam wordt geplaatst in de microkamer, en dat het dier is immobiel. De luchtpijp moet zichtbaar zijn. De rest van dePDMS chip moet in contact met het dekglaasje. Opmerking: Zie de figuren 2E en 2F voor voorbeelden van dieren correct geïmmobiliseerd in de chip. Sommige ingevuld oriëntaties getoond in Figuren 2G en 2H. Plaats de larve chip (PDMS chip + glas dekglaasje) op de microscoop. De larve chip, de slang en de spuit moet zorgvuldig worden behandeld om loslating van het PDMS chip van het dekglaasje te voorkomen. Voor een rechtopstaande microscoop, bevestig de 'top' kant van de chip aan de microscoop podium met dubbelzijdige tape (figuur 1C). Gebruik een sterk vergrotende doelstelling (olie-immersie, 40-63X wordt aanbevolen) om structuur (s) van het dier van belang vinden en voer de beeldvorming. In sommige gevallen kan een kleinere vergroting nodig om het gewenste gebied van beeldvorming te identificeren voordat het naar hogere vergroting. Bij beeldvorming is voltooid, laat het vacuüm door het schakelen van de klep naar de positiedat open is voor het milieu. Maak de PDMS chip van het dekglaasje. De larve moet onmiddellijk beweeglijk zijn. Gebruik een tang om de larve van de microkamer te verwijderen en plaats voorzichtig het larve op een druivensap agar plaat voor herstel. 3. Induceren van een Nerve Crush Letsel aan larvale Segmentale Zenuwen Volg stap 2.3 te isoleren vroeg geënsceneerde 3 larven e instar van het gewenste genotype. Zoals beschreven in stap 2.3 baden de larven in water om het voedsel te verwijderen. Gebruik een standaard fly CO 2 anesthetization station, met CO 2 pad onder een dissectie stereomicroscoop gehouden, om de larven te onderwerpen. Larven moet immotile worden na plaatsing op de CO 2-pad voor 1-2 minuten. Plaats nu een enkele verdoofde larve op een druivensap agar plaat onder de stereomicroscoop. Draai het dier ventrale zijde tot aan de buikzenuwkoord visualiseren en segmentale zenuwen door cuticula ( <strong> Figuur 3). Zorg ervoor dat de larve is volledig immotile. Met behulp Dumostar nummer-5 tang, knijp de segmentale zenuwen strak via de cuticula voor 5-10 sec. Als dit correct is gedaan, de cuticula intact blijft en het lichaam muur wordt niet doorboord. Opmerking: De schade kan worden uitgevoerd op verschillende posities langs de anterior-posterior lichaamsas, zolang de buikzenuwkoord, speekselklieren en darmen niet beschadigd. De meest effectieve schade locatie aan het einde van de 3e abdominaalsegment, zie figuur 3D. Letsel op deze locatie beschadigt de meest zenuwen en is het makkelijkst te reproduceren zonder het doden van het dier. Na de blessure, draait het dier zodat de ventrale zijde naar beneden op de druif plaat. Het moet in staat zijn om haar hoofd te bewegen en te eten. Als de blessure succesvol was, dan is de achterste helft van de larve zal worden verlamd. Houd de gewonde dieren op het druivensap agar plaat op 25 &# 176, C de gewenste tijd overeenkomstig het experimentele doel. Voor motoneuronen, de proximale stomp begint te ontkiemen binnen 8-10 uur op letsel 14, en de distale stomp begint te ontaarden binnen 6-8 uur 15. Voor klasse IV da sensorische neuronen, de proximale stomp begint te ontkiemen binnen 4-6 uur, en de distale stomp start te ontaarden binnen 3-4 uur na het letsel. Opmerking: met geschikte Gal4 drivers en fluorescente reporters, kunnen de kiemen en degeneratie worden waargenomen in de larve chip (zie bijvoorbeeld figuur 6).

Representative Results

De larve chip bestaat uit een enkele laag PDMS blok (a PDMS chip) waarvan het ontwerp is beschreven in schema in figuur 1. (Zie ook de aanvullende DXF-bestand voor het ontwerpen van uw eigen vorm). De larve microkamer, vacuümpoort, en perimeter kanalen (Figuur 1A) zijn 140 micrometer inkepingen in het PDMS chip. De chip wordt geplaatst bovenop een vroege opgevoerd 3e instar larven, die rust op een dekglaasje met olie (Figuren 1B en 1 C). De olie-glas interface tussen het dekglaasje en PDMS chip zorgt voor een afdichting te worden gemaakt op verzoek van een mild vacuüm. Dit zegel vallen de larven in de kamer, en sinds het begin van gefaseerde larve 3 e instar is iets dikker dan de kamer, het afdichten van de kamer zorgt voor een aantal fysieke vernauwing op het dier, effectief immobiliseren en het beperken van de beweging. In deze geïmmobiliseerde toestand, bepaalde ventralelichaam structuren, zoals de buikzenuwkoord en segmentale worden dicht geduwd om dekglaasje. Dit is voordelig voor de beeldvorming, omdat in de geïmmobiliseerde staat deze structuren binnen de werkafstand van 40X en 63X doelstellingen kunnen liggen. Nadat het vacuüm is vrijgegeven, kan de larve gemakkelijk uit de microkamer, waardoor aanvullende experimenten worden uitgevoerd. Deze zuiver mechanische immobilisatie aanpak kan 90% van de larven in leven na continue perioden immobilisatie tot 1 uur 12. Het vacuüm wordt gecreëerd door een eenvoudige 20 ml spuit, vandaar de gehele unit is eenvoudig te transporteren van een stereomicroscoop, waar de positionering in de kamer wordt uitgevoerd, een confocale of epifluorescentiemicroscoop, waar live-imaging wordt uitgevoerd. De spuit is verbonden met de vacuümpoort via polyetheen buizen en 23 G naalden afgifte (met slot hubs verwijderd), zoals beschreven in stap 1,6-1,14. Voor omgekeerde microscopen, de slangen spuit zijn via de bovenkant van de chip (fig. 1B, 2A en 2 B). Voor rechtopstaande microscopen en verbinden via een poort aan de zijkant van de chip (figuren 1C, 2C en 2D). De configuratie voor omgekeerde microscopen iets gemakkelijker te gebruiken. De spuit wordt getrokken een zacht vacuüm (ongeveer 10 psi), waarin de olie-glass-PDMS-interface bindt aan een afdichting tussen het dekglaasje en het PDMS inrichting te vormen, vangen en immobiliseren van de larve in de kamer te creëren. De plaatsing van de larve in de microkamer (2,7-2,10 stappen in het protocol) is essentieel voor effectieve immobilisatie en overleving (fig. 2E-H). Als het dier is te groot voor de kamer, (figuur 2G), of als zijn hoofd en de luchtpijp worden gevangen tussen de rand van de kamer en de coverslip (Figuur 1H), dan is het onwaarschijnlijk dat de procedure overleven. De volgende zijn enkele voorbeelden van het gebruik van de larvale chip verschillende cellulaire reacties bestuderen neuronen (figuren 4-7, Film S1 en S2 Film). Beeldverwerking van snelle axonale transport: De larve chip werd gebruikt om het imago van de kinesine-gemedieerd transport van synaptische blaasjes binnen de afzonderlijke perifere axonen (Figuur 4 en Movie S1) De anterograde (~ 1,0 micrometer / sec) en retrograde (~ 0,8 micrometer / sec. ) beweging van deze blaasjes kunnen gemakkelijk worden bestudeerd uit films verzameld op een draaiende schijf confocale microscoop. Plaatsing van de dier laser microchirurgie. Een sensorisch neuron dendriet werd doorsneden met een gepulseerde UV dye laser (figuur 5 en Film S2) protocollen voor het gebruik van de tzijn methode voor microchirurgie kan elders 16,17 worden gevonden. De efficiënte immobilisatie techniek biedt een snelle tijdschema veranderingen in de verwonde neuron, zoals veranderingen in intracellulair calcium (gedetecteerd door de genetisch gecodeerde Ca2 + indicator GCamp3.0 18), worden gedetecteerd en gemeten (Figuur 5). Studie van regeneratieve en degeneratieve reacties op letsel: Als het dier is toegestaan ​​om te rusten tussen beeldvorming sessies, de larve chip vervolgens gebruikt worden om te studeren cellulaire gebeurtenissen die zich voordoen over een groot bereik van tijdschalen. Bijvoorbeeld, zowel regeneratieve en degeneratieve reacties op axonalverwonding, die gedurende een tijdsbestek van 15 uur kan worden afgebeeld in de larve chip (figuur 6). In dit voorbeeld werden de axonen van octopaminergic motoneuronen gewonden via de deelzenuwvoor verpletteren (figuur 3), in deel 3 van het protocol beschreven. Het proximale axon stomp,die nieuwe kiemen ondergaat, en de distale axonen, die varicosities vormen en vervolgens gefragmenteerd door het proces van Wallerian degeneratie, kunnen worden afgebeeld en onderzocht op verschillende tijdstippen na het letsel. Tracking photoconvertible fluorescente proteïnen tijd in vivo: De ontwikkeling van photoconvertible fluorescerende eiwitten, waarvan de fluorescentie onomkeerbaar verandert bij blootstelling aan UV-licht) kan een specifiek label een subset van eiwitten in een cel, en volgen het lot van de gelabelde eiwitten in de tijd 19 , 20. Deze techniek wordt meestal uitgevoerd in celkweek, maar met de larve chip kan genetisch gecodeerde photoconvertible eiwitten in bepaalde cellen in vivo te volgen. Als voorbeeld tonen we Denda2-α-tubuline fusie-eiwit expressie van klasse IV da sensorische neuronen kunnen worden photoconverted in cellichamen (figuren 7A en <strong> 7 B). Het transport van de photoconverted eiwitten kunnen vervolgens worden gevolgd in de tijd: binnen twee dagen konden we een aanzienlijke hoeveelheid photoconverted eiwit te detecteren in de axon uiteinden van de sensorische neuronen, die liggen ~ 1 mm van de oorspronkelijke locatie in het cellichaam (figuren 7A en 7 C). Alle beschreven voorbeelden (figuren 4-7 en films S1 en S2) werden afgebeeld met een draaiende schijf confocale systeem, bestaande uit een Nipkow CSU10 scanner en C9100-50 EMCCD camera gemonteerd op een Axio Observer met 63X (1.5 NA) olie objectief, en gedreven met behulp Volocity acquisitie software. Figuur 1. </strong> Schematische cartoons voor het gebruik van de larve chip. (A) De larve chip bestaat uit de PDMS chip, aangegeven in lichtblauw, gehandeld op grond van een glazen dekglaasje. De chip bevat 140 micrometer dik microfluïdische kanalen, aangegeven in het wit. De centrale microkamer is ontworpen om goed passen in een vroeg opgevoerd 3 e instar Drosophila larve (beeldverhalen in lichtgroen). Een DXF bestand met exacte afmetingen die kunnen worden gebruikt om de mal te ontwerpen wordt verstrekt als aanvullende gegevens. Schaal bar = 1,5 mm. (BC) Side-standpunten van schema's voor het laden van een larve in een larve chip. De larve zit ventrale zijde naar beneden op een dekglaasje, en zijn lichaam ligt binnen de 140 micrometer diep microkamer. Een 20 ml spuit is verbonden met de vacuüm inlaat poort en wordt gebruikt om een ​​zacht vacuüm induceren. De Halocarbonolie-PDMS-glas-interface is gebonden door het vacuüm in een goede afdichting, die de larve in de microkamer beperkt. Dit zegel is gemakkelijk omkeerbaardoor het vrijgeven van de druk van de spuit, waarna het dier herwint direct motiliteit. Voor rechtopstaande microscopen (B), wordt de injectiespuit vacuüm aangesloten via Polyethyleen-50 slang van de bovenzijde van de chip. Voor omgekeerde microscopen (C), worden deze verbindingen gemaakt van de zijde van de chip, terwijl de 'top' van de chip via dubbelzijdige tape om de microscoop podium is bevestigd. Figuur 2. Afbeeldingen van PDMS chips en correcte positionering van larve. (AD). Foto's waarop PDMS chips voor omgekeerde en rechtopstaande microscopen. De 23 G doseernaald tip is ingebracht in het vacuüm-poort, waarmee verbinding via slangen in staat stelt om het vacuüm (spuit). Schaal bar = 1,5 mm. (EH). </strong> Bright gebied afbeeldingen van geïmmobiliseerde Drosophila larven. E en F tonen voorbeelden van correct geïmmobiliseerd dieren. De kleinere dier F de voorkeur dat meerdere beelden over langere tijdschalen (> 12 uur) uitgevoerd. G toont een dier dat te groot is, en H toont een klein dier dat verkeerde punt. Schaal bar = 1,5 mm. Klik hier voor grotere afbeelding. Figuur 3. Nerve crush van segmentale zenuwen in Drosophila larven. (A) Cartoon van de zenuw verliefd test. De segmentale zenuwen binnen een 3 e </sinschrijven> larve worden verpletterd door knijpen de ventrale nagelriem met nummer 5 pincet. (B) Zicht larvale zenuwstelsel van een dier ontleed 20 uur na zenuw crush. Immunokleuring voor neuronale membranen met anti-HRP antilichamen (rood) wijst op de hersenkwabben, buikzenuwkoord en lange segmentale zenuwen die motoneuron en sensorische neuron axonen bevatten. Een subset van de individuele motoneuronen worden gelabeld door de expressie van UAS-mCD8-GFP (groen) met de m12-Gal4 driver. Cellichamen en dendrieten van deze neuronen liggen in de buikzenuwkoord, terwijl hun axonen projecteren op het lichaam muur spieren via de segmentale zenuwen. (Deze bestuurt ook GFP expressie in spier 12 per larvale hemisegment, die kunnen worden beschouwd als anterior-posterior strepen aan weerszijden van het dier). De regio beschadigd door de crush is gemarkeerd met blauwe stippellijnen. Schaal bar = 70 micrometer. (C) Close-up uitzicht op de beschadigde axonen, 20 uur na het letsel. Links: deproximale axon heeft ondergaan kiemen en de nieuwe groei. Rechts: de distale axon is gefragmenteerd, met weinig GFP overgebleven, vanwege Wallerian degeneratie en klaring van puin. Schaal bar = 10 micrometer. (D) Afbeeldingen van de zenuw te verpletteren in een vroeg larve 3 e instar. De rode pijl wijst naar de ventrale zenuw koord. De locatie van de crush is naar de bodem van de 3e segment, zoals beschreven in de tekst Protocol (protocol 3). De afbeeldingen in D werden oorspronkelijk gepubliceerd in J. Cell Biol 191, 211-223, doi:.. 10,1083 (2010) Klik hier voor grotere afbeelding. Figuur 4. Time-lapse imaging van axonale transport van peptiderge synaptische blaasjes. Derat atriale natriuretisch peptide ANF getagd met GFP, UAS-ANF-GFP 21, werd uitgedrukt in specifieke motorische zenuwcellen met behulp van de eve-RRa-Gal4 driver 22. Live-beeldvorming van segmentale zenuwen onthult de snelle transport van ANF GFP-gelabelde peptidergisch blaasjes in axonen. Zie ook Movie S1. (A) Afzonderlijke beelden van motoneuron axonen afkomstig van live time-lapse imaging. Groene, rode en blauwe pijlen geven voorbeelden van anterograde, stationaire en retrograde blaasjes, respectievelijk. Schaal bar = 5 micrometer. (A ') Individuele termijnen uit de film werden samengevoegd met behulp van ImageJ. (B) A kymograaf gegenereerd uit time-lapse imaging van ANF-GFP vervoer, werd gegenereerd uit een verzameling van afzonderlijke frames verspreid over een minuut van Beeldvorming kan met behulp van de 'Multiple kymograaf' plug-in voor ImageJ 23. (C) Kwantificering van gemiddeld segmentale snelheden, die werden berekend uit de hellingen van gesegmenteerde sporen in kymographs. De groene balk presents anterograde segmentale velocity (n = 543) en de blauwe balk presenteert retrograde segmentale velocity (n = 548) van de blaasjes uit 10 kymographs. (D) Kwantificering van deeltjes dichtheid. Deeltje dichtheid werd gemeten door het aantal anterograde (groene balk), stationaire (weergegeven in rode balk) en retrograde (blauwe balk) deeltjes per 100 urn van axon lengte van 10 kymographs. De gegevens in dit figuur werden eerder gepubliceerd in Ghannad-Rezaie et al., PLoS One 7 (1), e29869, doi:. 0.1371/journal.pone.0029869 (2012). Figuur 5. Gebruik van de larve chip voor laser microchirurgie en calcium beeldvorming. Een dendriet van een klasse IV sensorisch neuron wordt doorsneden door met krachtige laserpulsen van een gepulste UV dye laser. Protocollen voor het gebruik van deze methode voor microchirurgie kan elders 16 worden gevonden. De effectieve immobilisatie in de larve chip zorgt voor snelle veranderingen in de intracellulaire calcium niveaus worden bestudeerd door live-imaging. In dit voorbeeld werd de genetisch gecodeerd calcium indicator GCaMP3.0 uitgedrukt in klasse IV dendritische arborization (C4da) sensorische neuronen met behulp van de PPK-Gal4 driver. (A) Time-lapse beelden van GCaMP3.0 intensiteit vals waren gekleurd volgens de kleur intensiteitsschaal de veranderingen in intensiteit weergeven tijd. Individuele frames werden geëxtraheerd uit een time-lapse filmpje (Movie S2) afgebeeld op een draaiende schijf confocale microscoop bij 5 beelden / sec. (B) Kwantificering van de calcium dynamiek in reactie op laser microchirurgie. De genormaliseerde voudige verandering van soma GCaMP3.0 fluorescentie-intensiteit (ΔF/F0) van individuele neuronen werd uitgezet tegen de tijd (n = 7, grijs weergegeven). De gemiddelde ΔF/F0 was vertegenwoordigd in oranje. De piek stijging van GCaMP3.0 intensiteit waargenomen tussen 1-2 sec na verwonding. Achtergrond werd afgetrokken van de ruwe G-CaMP3.0 fluorescentie-intensiteit. De gegevens in deze figuur werden eerder gepubliceerd in Ghannad-Rezaie et al., (2012) PLoS 7 (1):. E29869. doi: 10.1371/journal.pone.0029869 12. Figuur 6. Imaging axonale kiemen en degeneratie met de larve chip. Vertegenwoordiger confocale beelden van de proximale stomp (links) en distale stomp (rechts) van octopaminergic motoneuron axonen op verschillende tijdstippen na de zenuw crush. Beelden werden genomen op vergelijkbare locaties zoals getoond in figuur 3C. Deze neuronen zijn gelabeld door de expressie van een UAS-mCD8-RFP transgen met behulp van de Tdc2-Gal4 driver 24,25. De cellichamen van deze neuronen liggen in de buikzenuwkoord 24. Drie afzonderlijke axonen te zien binnen een segmentale zenuw en gemakkelijk opgelost van elkaar. Dit is een ideale situatie voor de studie van individuele cellulaire gebeurtenissen, zoals de versnippering van degenererende axonen, compleet binnen 15 uur voor deze neuronen. Beelden werden verkregen van levende dieren met behulp van de larve chip op 63X vergroting op een draaiende schijf confocale microscoop. Schaal bars = 10 micrometer voor links panelen (proximale stompen) en 20 urn voor rechts panelen (distale stompen). Klik hier voor grotere afbeelding. Figuur 7. De larvechip om photoconverted fluorescerende eiwitten over lange tijden en afstanden in levende dieren volgen. In dit voorbeeld, een fusie-eiwit van de photoconvertible fluorescerend eiwit Dendra2 19, gefuseerd aan α-tubuline wordt uitgedrukt van een UAS-Dendra2-α-tubuline transgen in klasse IV dendritische arborization (C4da) sensorische neuronen, met het ppk-Gal4 driver 26. (A) Schematische de photoconversion experiment. De cellichamen van de C4da neuronen liggen in de periferie en uit te breiden axonen door segmentale zenuwen naar synaptische terminals in de zenuw snoer vormen. De Dendra2-α-tubuline in een subset van cellichamen in de achterste helft van het dier wordt onderworpen aan fotoconversie door UV-belichting van 6 seconden met een standaard DAPI filter met Hg-lamp (links cartoon). Na verloop van tijd kan de photoconverted Dendra2-α-tubuline worden gedetecteerd op de synaptische terminals in de buikzenuwkoord. Dit geeft aan dat het tubuline eiwit is trandroeg over een lange afstand (van ~ 1-2 mm). Schaal bar = 1 mm (B) Voorbeeld afbeeldingen van Dendra2-α-tubuline in een klasse IV sensorisch neuron cel lichaam voor en na photoconversion. Schaal bar = 5 micrometer. (C) bijvoorbeeld beelden van synaptische terminals voor klasse IV sensorische neuronen op een van beide 0 uur of 48 uur na photoconversion van de cellichamen. De specifieke uiterlijk van photoconverted Dendra2-α-tubuline in de synaptische terminals op keer impliceert dat het eiwit afgelegd vanaf het cellichaam te axon uiteinde. Photoconversion en imaging op alle tijdstippen werd uitgevoerd in de larve chip. Schaal bar = 15 micrometer. Klik hier voor grotere afbeelding. Movie S1. Laser microchirurgie en calcium beeldvorming van een C4da neuron. een gepulseerde UV laser werd gebruikt om het doornemen van een primAry dendritische tak. Laser doorsnijding induceerde een snelle toename GCaMP intensiteit, die begon op de plaats van verwonding en reisden naar het cellichaam. UAS-GCaMP3.0 18 werd uitgedrukt in het C4da specifieke PPK-Gal4 driver 26. De films waren vals gekleurd om de relatieve intensiteit van GCaMP3.0 geven. De time-lapse imaging werd uitgevoerd met draaiende schijf confocale microscopie op 5 beelden / sec. Movie S2. Fast axonale transport van ANF-GFP in motorneuronen. De rat atriale natriuretisch peptide ANF getagd met GFP, UAS-ANF-GFP 21, werd uitgedrukt in specifieke motoneuronen met de eve-RRa-Gal4 driver 22. Het transport van deze peptiden bevatten blaasjes binnen larvale segmentale zenuwen werd afgebeeld op de larve chip op 300 msec / frame met behulp van een draaiende schijf confocale microscoop. Aanvullende Figuur 1 (DXF-bestand) DXF-bestand voor siliconen mal fabricage. Het bestand is bedoeld voor negatieve fotoweerstandmasker (donker ingediend masker voor SU-8) op een 4 inch silicium wafer. De tweede rij bevat 5 mallen voor het maken van de larve chips die gebruikt worden in dit protocol. Elk van deze chips (in rij 2) bevatten een ~ 5,4 mm x 1,5 mm kamer ontworpen om in een vroeg stadium larve 3 e instar passen. De eerste rij (rij 1) bevat een grotere kamer (~ 5.4 mm x 2 mm), terwijl de derde rij (rij 3) bevat een kleinere kamer (~ 4.4mm x 1.5mm). Deze kunnen worden gebruikt met larven van grotere en kleinere maten, respectievelijk. Schaalbalk = 2 mm.

Discussion

Maken of verkrijgen van de larve chip:

De larve chip bestaat uit een PDMS blok is (de zogeheten PDMS chip ') bevestigd aan een glazen dekglaasje. Het protocol in stap 1 beschrijft de procedure voor het maken en gebruiken larve chips, uitgaande van een SU-8 mal is beschikbaar. De SU-8 matrijs microfabricated fotolithografische patroonvorming door een 140 urn dikke SU-8 fotoresistlaag op een silicium wafer (voor details zie Ghannad-Rezaie et al.. 12). Zoals de microfabricage van de SU-8 schimmel toegang tot gespecialiseerde apparatuur nodig is, raden wij het ​​bestellen van een microfabrication faciliteit (bv. De LNF faciliteit aan de Universiteit van Michigan 14), of van een gieterij door toezending van het ontwerp van de chip die wordt verstrekt als een aanvullend bestand. Wil men het ontwerp van de chip PDMS (bijv. voor gebruik met larven van verschillende afmetingen), een CAD-software DXF (bijv. Autocad) behandelt veranderen worden gebruikt. Een SU-8 schimmel kan ook worden gemaakt in eigen huis volgens de instructies in Mondal et al.. Kan 27 Veel lezers vinden het handig om gewoon het verkrijgen van een monster PDMS chip om te proberen de techniek voor het vervaardigen van hun eigen chips. Deze wordt op verzoek ter beschikking worden gesteld.

Gebruik van de microfluïdische 'larve chip' voor live-imaging:

De immobilisatie werkwijze de larve chip vermijdt het gebruik van anesthetica en in plaats daarvan omvat druk, via de toepassing van een vacuüm, om beweging van het dier te beperken. Hoewel dieren immobilisatie kan overleven in de chip voor meerdere uren 12, een kortere immobilisatie periode (5-15 min) wordt aanbevolen. Dit is genoeg tijd voor de beeldvorming van vele cellulaire gebeurtenissen van belang, met inbegrip van veranderingen in de intracellulaire calcium, of snel axonale transport. Dit is ook voldoende tijd voor de gewenste manipulaties in levende dieren, zoals laser gebaseerde microchirurgie, photobleaching en photoconverSion.

Om gebeurtenissen in lengterichting over een langere periode in een enkel dier te bestuderen, dieren kunnen worden in de chip meerdere malen geplaatst en afgebeeld, gescheiden door perioden van rust. Druivensap agar-platen zijn ideaal voor rust tussen beeldvorming sessies, omdat ze zorgen voor een gemakkelijke bron van voedsel en vocht. Meerdere beeldvorming sessies wel invloed larvale overleving tot op zekere hoogte, omdat elke sessie brengt een aantal risico's voor het beschadigen van het dier (zie deel 2 in het oplossen van problemen, hieronder). Dieren kunnen routinematig worden afgebeeld> 5 keer in de loop van twee dagen met een meer dan 50% overlevingskans. Aangezien de dieren niet verdoofd, ze gezond en beweeglijk onmiddellijk na afgifte van het vacuüm in de chip. Er is derhalve geen behoefte aan herstel tussen beeldvorming sessies, dus de tijd afstand tussen sessies is flexibel en kan worden aangepast aan de doelstellingen van het experiment.

Problemen oplossen:

De meest voorkomende technische isvervolgt met larve chip en aanbevolen oplossingen zijn de volgende:

(1) Het dier is te veel bewegen. Te veel mobiliteit kan interfereren met de beeldvorming doelen. De meest voorkomende redenen als de larve chip a) het dier is te klein voor de chip, of b) de toegepaste onderdruk tijdens de immobilisatie stap wordt aangetast. De larve chip beschreven in dit protocol is bedoeld voor de vroege geënsceneerde larven 3 e instar. De optimale grootte van het dier 3.5-4 mm (aan de sagittale as). Om de onderdruk voldoende is, trekt de spuit 2-2,5 ml of totdat weerstand wordt gevoeld in de handgreep. Een indicatie dat het vacuüm werkt, is dat kleine luchtbellen in de perimeter kanaal kan worden gezien bewegen langzaam naar het vacuüm bron. Een andere indicatie dat het dekglaasje altijd moet reizen met de chip wanneer de chip wordt opgetild boven (en dit is de aanbevolen methode voor het transporteren van de kamerzodra de larven is gepositioneerd en het vacuüm is ingeschakeld). Het vacuüm kan worden bemoeilijkt indien er scheuren in de buis, of er olie in de buis. Dit kan gemakkelijk worden opgelost door het vervangen van de 23 G afgeven naaldpunt en polyethyleen-50 buis (van stap 1,6-1,14).

(2) Het dier sterft na beeldvorming in de chip. De procedure is bedoeld om minimale stress veroorzaken bij het ​​dier, en andere dieren, wild-type genotype hebben een> 90% overlevingskans, zelfs na een uur van immobilisatie op de chip 12. Aangezien sommige genotypes minder veerkrachtig om de stress van de chip kan zijn, controleer dan eerst dat wild-type dieren (bijvoorbeeld Canton S) overleven de immobilisatie techniek. a) De meest voorkomende oorzaak van sterfte is onjuist positioneren van de larve (zie figuren 2G-H). Als delen van de cuticula, het hoofd en de luchtpijp zijn niet helemaal in de kamer, dan kunnen ze beschadigd raken tijdens de immobilisatie, en eenlarve dat te groot is voor de chip (> 4 mm) minder kans om te overleven. b) Een minder voorkomende oorzaak voor letaliteit is het gebruik van te veel druk of vacuüm bij het plaatsen van chip. Indien juist gepositioneerd in de chip, de druk die door het vacuüm wordt goed verdragen. Overmatige druk, hetzij van het vacuüm of in de eerste fase van het positioneren van het dier kan een probleem zijn. Het beste is om de mate van druk die nodig is door empirisch onderzoek met wildtype larven van de juiste grootte te leren. c) Als er te veel Halocarbonolie dekt luchtpijp van het dier het dier kan mogelijk problemen met de lange-termijn overleving. De olie speelt een aantal belangrijke rollen in de chip: het is belangrijk voor het creëren van het vacuüm, de optiek tijdens de beeldvorming en uitdroging tegengaat in de chip. Overmatige olie moet worden vermeden. (Dit kan ook leiden tot olie in de buizen en spuit, afbreuk het vacuüm). De voorgestelde protocol lagen gewoon de ventrale zijde van de larve met olie, dan reGaat overtollige olie door plaatsing van de larve op een schoon dekglaasje alvorens naar de uiteindelijke dekglaasje voor de beeldvorming. d) fototoxiciteitstests kan worden ervaren van de opnamesessie. Zoals bij elke live-imaging toepassing, is het ideaal om korte belichtingstijden te gebruiken met een lage intensiteit laserlicht, die het best bereikt met behulp van een zeer gevoelige camera of detector. Probeer om de verlichting te minimaliseren met UV-licht, waaronder een breed spectrum licht gecreëerd door Hg lichtbronnen.

Andere kwesties en toekomstige richtingen:

Aangezien deze methode niet verdovingsmiddelen gebruiken, het hart van het dier blijft kloppen. Dit zorgt voor een aantal onvermijdelijke mobiliteit, die beeldvorming in sommige plaatsen meer dan anderen beïnvloedt. De voorbeelden tonen dat de buikzenuwkoord, segmentale zenuwen en lichaamswand gemakkelijk kan worden afgebeeld zonder tussenkomst van de hartslag. In gevallen waarin de hartslag beïnvloedt beeldvorming, kan de regelmatige bewegingen soms worden gecorrigeerd voor metin analyse software (bijvoorbeeld de Image Stabilizer plugin voor ImageJ). Dit werkt goed als afzonderlijke objecten bewegen op een snelle tijdschaal (bijvoorbeeld ~ 1 micrometer / sec voor snelle axonale transport) of op een zeer langzame tijdschaal (minuten tot uren). Echter, wanneer het object (en) van belang bewegen met een bereik van snelheden en richtingen, kan het moeilijker zijn om te corrigeren voor de hartslag veroorzaakte bewegingen.

Een ander probleem is een lichte variatie in de optica van dier tot dier, of tussen meerdere beeldvorming sessies van hetzelfde dier in de chip. Hoe dieper het voorwerp van belang is in het dier, hoe groter deze variant zal zijn. Segmentale zenuwen en de buikzenuwkoord zijn doorgaans te diep binnen dan dieren af ​​te beelden op een gewone microscoop. Het milde druk ervaren in de larve chip duwt Maar deze structuren zeer dicht bij de nagelriem en dekglaasje. De exacte afstand van deze structuren van het dekglaasje zullen kleine schommelingen van tr hebbenial voor de rechter. De variatie objecten sluit de cuticula, zoals de cellichamen van sensorische neuronen, minder. Daarom is het belangrijk, met name voor het maken van metingen van de intensiteit, een groot aantal dieren en onafhankelijke experimenten gebruiken in verband met de verscheidenheid van optiek.

Hoewel de hier getoonde voorbeelden gericht op processen in neuronen, moet de aanpak vatbaar voor een structuur beeldvorming in het dier dat in de focus diepte van het microscoopobjectief kan worden gebracht zijn. Dit omvat de cuticula, lichaam muur spieren, en hun NMJs. Luchtpijp aan de buikzijde van het dier en mogelijk delen van het spijsverteringskanaal worden afgebeeld. Het dier kan ook worden gepositioneerd met zijn dorsale zijde naar het dekglaasje korte termijn beeldvorming van structuren nabij het dorsale oppervlak. De mogelijkheid om beeld structuren diep in het dier wordt beperkt door de werkafstand van het microscoopobjectief gebruikt. Structuren zoals imaginal schijven zijn niet toegankelijk voor een sterke vergroting (bijv. 40X) doelstellingen.

De larve chips beschreven in dit protocol zijn ontworpen voor larven in de 3 fase vroege derde instar (variërend in grootte 3,5-4 mm). Maar veel interessante vragen vereisen beeldvorming in verschillende larvale stadia. Kleinere chips instar larven nd 2, of groter chips geschikt late 3e stadia plaats kan gemakkelijk worden ontworpen met behulp van hetzelfde principe. (Aanvullende Figuur 1 bevat een gemakkelijk aanpasbaar DXF-bestand voor het maken van siliconen mallen met veranderde kamer maten). De simpele principe van de omkeerbare afdichting kan zelfs worden toegepast op andere organismen zoals C. elegans of zebravis, met de belangrijkste variant zijn de kamergrootte. Een bruikbare toekomstige richting is een chip die veel dieren kunnen immobiliseren tegelijk te gebruiken voor screeningsdoeleinden ontwerpen. Echter, dit zou het ontwerp moeten significant verschillend te zijnvan het huidige apparaat, waarbij de punten van positioneren van de dieren in de chip moet onafhankelijk geregeld voor elk dier.

De zenuw verliefd test voor het bestuderen van letsel reacties in larvale perifere zenuwen:

De zenuw verbrijzeling test beschreven voor larvale segmentale zenuwen is een eenvoudige methode voor het introduceren van een letsel van perifere axonen in Drosophila. Voordelen van deze methode zijn: a) het is eenvoudig uit te voeren met standaard gereedschap in een Drosophila lab (een stereomicroscoop CO2 bron en forceps), b) kan snel worden uitgevoerd voor vele dieren, waardoor biochemische analyse zenuw koorden na verwonding haalbare 14 c) de moleculaire en cellulaire reacties op deze letsels zijn zeer reproduceerbaar 14,15,28 en kan worden gebruikt om processen die belangrijk zijn in gewervelde neuronen 29,30 ontdekken.

Alternatieve werkwijzen voor het verwonden van neuronen te focusa high-power laser, bijvoorbeeld een gepulste UV of femtosecondlaser, een axon te verbreken via laser microchirurgie 17,31-33. De larve chip is een ideale methode voor het positioneren van het dier zoals microchirurgie. Vanwege kleine verschillen in de optica tussen onderzoeken zoals hierboven, de laser gebaseerde methode kan moeilijker te reproduceren larven, vooral in larvale segmentale zenuwen. Ook laser gebaseerde axonalverwonding vergt meer tijd om elk dier te positioneren, dus is moeilijk uit te voeren op grote schaal (met een groot aantal dieren).

Problemen oplossen:

De meest voorkomende technische kwestie van de zenuw te verpletteren is de dood van schade aan inwendige organen. Bij het uitvoeren van de crush, is het belangrijk de buikzenuwkoord, speekselklieren, of darmen niet bekneld raken. Het is ook belangrijk de cuticula niet te doorboren. Deze kwesties worden best vermeden doordat de tang bij een hoek van 45 ° naar de cuticula oppervlakteactievee (zie figuur 3).

De kwaliteit van de tang heeft een grote invloed op de effectiviteit van de crush en overleving daarna. Wij raden Dumostar nummer 5 tang. Om hun scherpte behouden, moet de tang voorzichtig worden behandeld, niet voor andere doeleinden gebruikt, en vervangen zodra zij bot of verbogen.

De grootte van het dier kan ook invloed op de effectiviteit van de crush. Kleine dieren (minder dan 3 mm in lengte) zijn veel minder kans om de schade te overleven. Bij grotere dieren, (zwerven 3e stadia), is het moeilijker om de zenuwen te lokaliseren en schade aan de grote speekselklieren en darmen voorkomen, en er is minder tijd om verwonding respons studie voor de verpopping. De zenuw verliefd is het meest effectief uitgevoerd in larven begin 3 e instar (die ~ 3-4,5 mm in de lengte langs de achterwaartse as staan).

Het voedselbron dat het dier wordt verhoogd op kan rakensterkte van de cuticula en de overleving na de crush. Het wordt aanbevolen om dieren in voedsel gemaakt van een standaard gist-glucose recept verhogen.

De beste methode om te leren hoe je de crush effectief te doen is om te oefenen op veel dieren, eerst met het primaire doel van het bereiken van de overleving (en niet verpopping) 24 uur na de crush. Beginners hebben doorgaans een lage overlevingskans (bijv. 10%), maar zodra de techniek wordt aangeleerd, kan de overlevingskansen bereiken ~ 90%.

Andere kwesties en toekomstige richtingen:

De crush test biedt een krachtige methode om de kiemen van axon proximale bestuderen om de schade plaats en degeneratie van axonen en synapsen distaal van de verwonding. Terwijl de tarieven van degeneratie variëren tussen de verschillende soorten neuronen, ze zijn zeer reproduceerbaar voor een gegeven type neuron, die bewijs van de reproduceerbaarheid van het letsel assay.

In tegenstelling, de regeneratieve 'kiemenrespons waargenomen bij proximale axonen is een grotere uitdaging om te studeren. Alle axonen in de deelzenuwvoor initiëren uitgebreide kiemen dicht om de schade website (zie bijvoorbeeld Figuur 6 en Figuur 3). Maar de omvang van kiemen kan variëren van neuron tot neuron, en is moeilijk te kwantificeren. Een vergelijkbare mate en variabiliteit in het kiemen kan worden waargenomen na meer focale laesies van enkele motoneuronen in segmentale zenuwen geïntroduceerd door middel van een UV-pulsed dye laser. We interpreteren het nondiscriminate gerichtheid van de kiemen wordt veroorzaakt door de afwezigheid van leiding signalen in het segmentale zenuwen. Daarentegen sensorisch neuron axons verwond laser dicht bij hun cellichamen ondergaan nieuwe axonale groei in dezelfde richting als de verloren axon 34. Axonen in deze regio van het dier zijn waarschijnlijk blootgesteld aan meer specifieke positie-informatie voor begeleiding van de regenererende axonen. De omgeving binnen segmentale zenuwen waarschijnlijk veel resemblan hebbence voor het milieu die de axonen oorspronkelijk genavigeerd tijdens hun begeleiding in het embryo, dus naar verwachting geen informatie hoeft te regenererende axonen leiden.

Een andere beperking voor het bestuderen van de regeneratie met behulp van de deelzenuwvoor verliefd test is dat de benadeelde zintuiglijke en motoneuron axonen hebben nog steeds een aanzienlijke afstand tot (0,25-1 mm) om hun doel te bereiken, en een beperkt tijdsbestek (<3 dagen) te dekken voordat het dier ondergaat verpopping. Een recente studie heeft een genetische manipulatie van de prothoraciotropic hormoon receptor die de duur van de 3e instar larvale stadium 35 triples geïdentificeerd. Deze manipulatie is het tijdschema verlengen bestuderen van de terugwinning en degeneratie van neuronen na verwonding significant, 9 in plaats van 3 dagen. Dit kan lang genoeg om nieuwe evenementen, zoals de heraansluiting van een gewonde axon met zijn postsynaptische doel te observeren zijn, vooral als de schade wordt veroorzaakt in de buurt van de synaptische einde.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation, (licentienummer IOS-0842701 om CAC), en het National Institute of Health (R00MH080599 naar BY, R21 NS062313 naar NC, en NS069844 te CAC). We willen graag James Schutt, Emily Han en Leni Truong erkennen voor de technische ondersteuning en de Bloomington Stock centrum voor vlieg lijnen. Alle chips werden gefabriceerd op Lurie Nanofabrication Facility van de Universiteit van Michigan.

Materials

0.5 mm Polyethylene tubing Fisher scientific 14-170-11B Polyethylene tubing, I.D. = 0.023’’, O.D. = 0.038’’
1 mm Polyurethane tubing Fisher scientific BB521-63 Polyurethane tubing, I.D. = 0.063’’,  O.D. = 0.125’’
barb to barb connector Bio Rad 732-8300 0.8 mm barb to barb connector
3-way stopcock valve Bio Rad 732-8104 Screw on valve for the syringe
Syringe (20 ml) Fisher scientific 14-817-33 Screw on 20 ml syringe for  generating vacuum
Dispensing needles, 23 G (.4mm I.D., .6mm O.D.) McMaster-Carr 75165A684 Needle for outlet connection
Dispensing needles, 21 G, (.6mm I.D.,  .8mm O.D.) McMaster-Carr 75165A679 Needle for outlet connection
Halocarbon oil Sigma H8898 Halocarbon oil 700
Dumostar Number 5 Forceps Roboz RS-498 For nerve crush
PDMS Kit (Base and curing agent) Ellsworth 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant 0.5 kg Kit Clear
Glass Coverslips Fisher scientific 12-544-C 24 x 40 mm (thickness according to recommendation for your microscope objective)
Disposable Plastic Cup (9 oz.)
Plastic coffee stirrer stick
Razor Blade
Grape juice agar plates See http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925 for recipe
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
  2. Gunawardena, S., et al. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
  3. Miller, K. E., et al. Direct observation demonstrates that Liprin-alpha is required for trafficking of synaptic vesicles. Curr. Biol. 15, 684-689 (2005).
  4. Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila. Neuron. 22, 719-729 (1999).
  5. Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
  6. Schmid, A., et al. Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo. Nat. Neurosci. 11, 659-666 (2008).
  7. Fuentes-Medel, Y., et al. Glia and muscle sculpt neuromuscular arbors by engulfing destabilized synaptic boutons and shed presynaptic debris. PLoS Biol. 7, (2009).
  8. Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. . Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. , 476-480 (2012).
  9. Sandstrom, D. J. Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance. Anesthesiology. 108, 434-446 (2008).
  10. Sandstrom, D. J. Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction. J. Physiol. 558, 489-502 (2004).
  11. Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12, 372-385 (2011).
  12. Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. Microfluidic chips for in vivo imaging of cellular responses to neural injury in Drosophila larvae. PloS one. 7, (2012).
  13. Schmid, A., Sigrist, S. J. Analysis of neuromuscular junctions: histology and in vivo imaging. Methods Mol. Biol. 420, 239-251 (2008).
  14. Xiong, X., et al. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191, 211-223 (2010).
  15. Xiong, X., Collins, C. A. A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade. J. Neurosci. 32, 610-615 (2012).
  16. Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo Laser Axotomy in C. elegans. J. Vis. Exp. (51), (2011).
  17. Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans. J. Vis. Exp. (57), (2011).
  18. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
  19. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2. 2, 2024-2032 (2007).
  20. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24, 461-465 (2006).
  21. Rao, S., Lang, C., Levitan, E. S., Deitcher, D. L. Visualization of neuropeptide expression, transport, and exocytosis in Drosophila melanogaster. J. Neurobiol. 49, 159-172 (2001).
  22. Fujioka, M., et al. Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila. Development. 130, 5385-5400 (2003).
  23. Rietdorf, J., Steitz, A., Heidelberg, E. Linear unmixing macro for ImageJ. European Advanced Light Microscopy Network. , (2004).
  24. Koon, A. C., et al. Autoregulatory and paracrine control of synaptic and behavioral plasticity by octopaminergic signaling. Nat. Neurosci. 14, 190-199 (2011).
  25. Yarali, A., Gerber, B. A Neurogenetic Dissociation between Punishment-, Reward-, and Relief-Learning in Drosophila. Front. Behav. Neurosci. 4, (2010).
  26. Kuo, C. T., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Dendrite-specific remodeling of Drosophila sensory neurons requires matrix metalloproteases, ubiquitin-proteasome, and ecdysone signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15230-15235 (2005).
  27. Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila. J. Vis. Exp. (67), (2012).
  28. Xiong, X., et al. The highwire ubiquitin ligase promotes axonal degeneration by tuning levels of nmnat protein. PLoS Biol. 10, (2012).
  29. Shin, J. E., et al. Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration. Neuron. 74, 1015-1022 (2012).
  30. Watkins, T. A., et al. DLK initiates a transcriptional program that couples apoptotic and regenerative responses to axonal injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 4039-4044 (2013).
  31. Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway. Science. 323, 802-806 (2009).
  32. Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nat. Methods. 5, 531-533 (2008).
  33. O’Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (24), (2009).
  34. Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite. Mol. Biol. Cell. 21, 767-777 (2010).
  35. Miller, D. L., Ballard, S. L., Ganetzky, B. Analysis of synaptic growth and function in Drosophila with an extended larval stage. J. Neurosci. 32, 13776-13786 (2012).

Tags

MicrofluidicsDrosophila LarvaeLive ImagingInjury ResponsePDMS MicrochamberImmobilizationNerve CordSegmental NervesBody Wall MusclesHigh-resolution ImagingAnestheticsPhysiological ProcessesLongitudinal StudiesAxon TransportCalcium ResponsesPhoto-convertible ProteinsAxonal InjuryNerve Crush

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang , X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (84), e50998, doi:10.3791/50998 (2014).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image