باستخدام رقائق الموائع الدقيقة للتصوير لايف ودراسة الردود الإصابات في<em> ذبابة الفاكهة</em> يرقات
Summary
يرقات ذبابة الفاكهة هي نظام نموذجا جذابا للتصوير الحية نظرا لبشرة شفافة وعلم الوراثة الخاصة بهم قوية. يصف هذا البروتوكول كيفية الاستفادة من جهاز PDMS طبقة واحدة، ودعا 'رقاقة اليرقة' للتصوير حية من العمليات الخلوية داخل الخلايا العصبية من 3 طور مرحلي الثالثة يرقات ذبابة الفاكهة.
Abstract
التصوير الحي هو أسلوب مهم لدراسة العمليات البيولوجية الخلية، ولكن هذا يمكن أن يكون تحديا في الحيوانات الحية. بشرة شفافة من يرقة ذبابة الفاكهة يجعلها كائن نموذجا جذابا للدراسات التصوير الحي. ومع ذلك، تحديا هاما للتقنيات التصوير الحية يتمثل في شل noninvasively ووضع حيوان على المجهر. ويعرض هذا البروتوكول طريقة بسيطة وسهلة الاستخدام للشل حركة والتصوير يرقات ذبابة الفاكهة على polydimethylsiloxane (PDMS) جهاز ميكروفلويديك، الذي نسميه 'رقاقة اليرقة'. وتتألف الشريحة اليرقة من PDMS microchamber تركيب دافئ التي يتم تركيبها على الزجاج ساترة رقيقة، والتي، بناء على طلب من فراغ عن طريق حقنة، يشل الحيوان ويجلب هياكل بطني مثل الحبل العصبي والأعصاب قطعي، والجسم عضلات جدار، على مقربة من ساترة. وهذا يسمح لالتصوير ذات الدقة العالية، والأهم من ذلك، يتجنب استخدام انوsthetics والمواد الكيميائية، مما يسهل دراسة مجموعة واسعة من العمليات الفسيولوجية. منذ اليرقات بسهولة استعادة من الشلل، ويمكن أن تخضع بسهولة لجلسات التصوير متعددة. وهذا يسمح للدراسات طولية على دورات زمنية تتراوح بين ساعات إلى أيام. يصف هذا البروتوكول خطوة بخطوة كيفية إعداد شريحة وكيفية الاستفادة من رقاقة لتصوير حي للأحداث العصبية في 3 الثالثة طور مرحلي اليرقات. وتشمل هذه الأحداث في النقل السريع من العضيات في محاور عصبية، والاستجابات الكالسيوم إلى الإصابة، ودراسات الوقت الفاصل بين الاتجار وصور قابلة للتحويل البروتينات لمسافات طويلة وجداول زمنية. تطبيق آخر من الشريحة هو دراسة التجدد والاستجابات التنكسية للإصابة محور عصبي، وبالتالي فإن الجزء الثاني من هذا البروتوكول يصف الإجراء الجديد وبسيطة للإصابة محاور داخل الأعصاب الطرفية عن طريق سحق العصب قطعي.
Introduction
ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة السوداء البطن، وقد استخدمت بوصفها النموذج الحي لأكثر من 100 سنة، ولقد أثبتت تأثيرها الفعال في تحديد الإشارات الأساسية والمسارات التنموية التي يتم حفظها من اللافقاريات إلى الإنسان. التصوير الحي هو مدخلا مهما لدراسة الآليات الخلوية، والخطة بسيطة وبشرة الجسم الشفاف لليرقة ذبابة الفاكهة يجعلها جذابة للنظام التصوير الحية، لا سيما وأن هناك العديد من الأدوات الجينية المتاحة للتعبير عن البروتينات الموسومة fluorescently في أنواع معينة من الخلايا.
تحديا هاما للتقنيات التصوير الحية يتمثل في شل noninvasively ووضع حيوان للفحص المجهري. وتشمل النهج الشلل التقليدية تشريح 1،2 أو استخدام الكلوروفورم، وكلاهما قتل الحيوان. والتخدير استخدمت أيضا الأثير 4 وisofluorane 5-8. بينما توفر العديد من المزايا التخدير، كما أنها تمنع النشاط العصبي وعلم وظائف الأعضاء الهامة (بما في ذلك ضربات القلب) 9-11، وبالتالي يمكن أن يؤثر على عملية دراسة وخلق الضغط على الحيوان. وهناك أيضا مخاوف تتعلق بالسلامة الإنسان للعمل مع الأثير، وisofluorane.
قمنا بتطوير طريقة خالية من المخدرات لشل حركة يرقات ذبابة الفاكهة في طبقة PDMS الجهاز ميكروفلويديك واحد، والذي نسميه 'رقاقة اليرقة' 12. وهذا البروتوكول تصف كيفية الحصول أو جعل رقاقة يرقة، وكيفية الاستفادة منه لتصوير حي في أوائل نظموا 3 طور مرحلي الثالثة اليرقات. تتألف الرقاقة من microchamber تركيب دافئ، والتي، بناء على طلب من فراغ عن طريق حقنة، يشل الحيوان عن طريق القوة الميكانيكية لطيف. طريقة تجميد يجلب هياكل بطني مثل الحبل العصبي والأعصاب قطعي، وعضلات جدار الجسم، على مقربة من ساترة الزجاج. وهذا يسمح لتصوير عالية الدقة من هذه الهياكل مع أبر العددية عاليةتلح (تضخم عالية) الأهداف.
وتشمل المزايا التي تتمتع بها رقاقة اليرقة على التقنيات التقليدية الأخرى ما يلي: (ط) استخدام رقاقة يرقة يحل محل استخدام المواد الكيميائية، والسماح لفي الجسم الحي التصوير من الحيوانات unanesthetized. (ب) استعادة اليرقات على الفور بعد الافراج عن رقاقة (على النقيض من فترة نقاهة 2 ساعة لisofluorane 8،13). وهذا يسمح للتصوير على جداول زمنية واسعة، بدءا من ميلي ثانية إلى دقيقة، لساعات وأيام. (ج) استخدام PDMS، والذي هو مادة قابلة للاختراق الغاز، وتمكن لنشر المستمر من الأوكسجين / الهواء من البيئة إلى الجسم اليرقة. (د) رقاقة سهلة وآمنة للاستخدام، و (ت) هو قابل لإعادة الاستخدام، ويمكن تصنيعها بأقل تكلفة.
بالإضافة إلى التعليمات الخاصة باستخدام رقاقة يرقة، وهذا البروتوكول تقديم عدة أمثلة لاستخدامه لدراسة الأحداث العصبية في 3 الثالثة طور مرحلي اليرقات. وتشمل هذه التصوير الحي من axonaالنقل لتر، الكالسيوم الاستجابات للإصابة، ودراسات الوقت الفاصل بين الاتجار وصور قابلة للتحويل البروتينات عبر مسافات طويلة وجداول زمنية.
تطبيق آخر من الشريحة هو دراسة الاستجابات العصبية للإصابة محور عصبي. لهذا يوصف إجراء إضافية (في الجزء 3) لإصابة في الأعصاب الطرفية محاور عصبية من قبل سحق العصب قطعي. هذا الفحص بسيط يمكن أن يؤديها على حد سواء بسرعة وبتكاثر تحت stereomicroscope تشريح القياسية، والذي يسمح لكثير من الحيوانات التي سيتم تجهيزها في نفس الوقت. الاستجابات الخلوية إلى إصابة يمكن دراستها عن طريق التصوير الحي في رقاقة اليرقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
صنع أو الحصول على رقاقة اليرقة:
يتكون رقاقة يرقة كتلة PDMS (يسمى 'رقاقة PDMS') تعلق على ساترة الزجاج. البروتوكول في الخطوة 1 يصف الإجراء لصنع واستخدام رقائق يرقة، على افتراض العفن SU-8 هو متاح. وmicrofabricated العفن SU-8 عن طريق الزخرفة photolithographically سميكة SU-8 طبقة مقاومة للضوء 140 ميكرون على رقاقة السيليكون (لمزيد من التفاصيل انظر Ghannad-رضائي وآخرون 12). كما التصنيع الدقيق من العفن SU-8 يتطلب الوصول إلى المعدات المتخصصة، نوصي تأمرها من منشأة التصنيع الدقيق (على سبيل المثال. مرفق LNF في جامعة ميشيغان 14)، أو من مسبك بإرسالهم تصميم رقاقة التي يتم توفيرها كملف التكميلية. إذا كان أحد يرغب في تغيير تصميم رقاقة PDMS (على سبيل المثال للاستخدام مع اليرقات من مختلف الأحجام)، وهو برنامج CAD الذي يعالج ملفات DXF (مثل أوتوكاد) يمكن استخدامها. وSU-يمكن أيضا أن تكون مصنوعة 8 العفن في المنزل باتباع إرشادات في موندال وآخرون قد تجد العديد من القراء 27 فإنه ملاءمة لمجرد الحصول على PDMS رقاقة عينة لمحاولة الخروج هذه التقنية قبل افتعال رقائق الخاصة بهم. وستتاح هذه متاحة بحرية عند الطلب.
استخدام ميكروفلويديك 'رقاقة اليرقة' للتصوير الحي:
طريقة الشلل في رقاقة يرقة يتجنب استخدام التخدير، وبدلا من ذلك ينطوي على الضغط، عبر تطبيق فراغ، لتقييد حركة الحيوان. بينما الحيوانات يمكن البقاء على قيد الحياة الشلل في رقاقة لساعات متعددة 12، وهي فترة أقصر الشلل (5-15 دقيقة) ويوصى. وهذا هو ما يكفي من الوقت لتصوير العديد من الأحداث الخلوية في المصالح، بما في ذلك التغيرات في الكالسيوم داخل الخلايا، أو نقل محور عصبي سريع. وهذا هو أيضا وقتا كافيا للتلاعب المطلوب في الحيوانات الحية، مثل ليزر مقرها المجهرية، photobleaching من وphotoconverسيون.
لدراسة الأحداث طوليا على مدى فترة زمنية أطول في حيوان واحد، ويمكن أن توضع الحيوانات في رقاقة وتصويرها عدة مرات، مفصولة فترات من الراحة. لوحات أجار عصير العنب هي مثالية للراحة بين جلسات التصوير، لأنها توفر مصدرا غذائيا سهلة والرطوبة. جلسات التصوير متعددة تفعل تؤثر على بقاء اليرقات إلى حد ما، لأن كل دورة يحمل بعض المخاطر بالنسبة لإتلاف الحيوان (انظر الجزء 2 في استكشاف الأخطاء وإصلاحها، أدناه). ولا يمكن تصوير الحيوانات بشكل روتيني> 5 مرات على مدى يومين مع معدل البقاء على قيد الحياة أكبر من 50٪. لأنه لا يتم تخدير الحيوانات، وأنهم يتمتعون بصحة جيدة ومتحركة على الفور بعد الافراج عن فراغ في رقاقة. هناك بالتالي حاجة لوقت الانتعاش بين جلسات التصوير، وبالتالي فإن التباعد الزمني بين الدورات مرنة ويمكن تعديلها لأهداف التجربة.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها:
التقنية الأكثر شيوعا هويقاضي مع رقاقة اليرقة والحلول الموصى بها ما يلي:
(1) هو الحيوان تتحرك كثيرا. الكثير من التنقل يمكن أن تتداخل مع الأهداف التصوير. الأسباب الأكثر شيوعا لهذا في رقاقة اليرقة هي) للحيوان صغير جدا لرقاقة، أو ب) للخطر الضغط فراغ تطبيقها خلال الخطوة الشلل. تم تصميم رقاقة يرقة الموصوفة في هذا البروتوكول للنظموا في وقت مبكر 3 اليرقات طور مرحلي الثالثة. الحجم الأمثل للحيوان هو 3.5-4 ملم في الطول (طول المحور الأمامي الخلفي). للتأكد من أن الضغط فراغ كاف، وسحب الحقنة 2-2.5 مل، أو حتى يشعر المقاومة في التعامل معها. واحد يدل على أن الفراغ هو العمل هو أن فقاعات صغيرة في محيط القناة يمكن أن ينظر إليها تتحرك ببطء نحو مصدر فراغ. مؤشر آخر هو أن ساترة يجب دائما مع رقاقة عندما يتم رفع شريحة من أعلى (وهذا هو الأسلوب المستحسن لنقل الغرفةبمجرد أن يتم وضع يرقات والفراغ هو على). الفراغ قد تتعرض للخطر إذا كان هناك تصدعات في أنابيب، أو إذا كان هناك النفط في الأنبوب. يمكن معالجة هذه الحالة بسهولة عن طريق استبدال 23 G الاستغناء طرف الإبرة وأنابيب البولي اثيلين-50 (من الخطوات 1،6-1،14).
(2) يموت الحيوان بعد التصوير في رقاقة. ويهدف هذا الإجراء إلى الحد الأدنى من الإجهاد يتسبب على الحيوان، والحيوانات البرية من نوع النمط الجيني لديهم معدل البقاء على قيد الحياة> 90٪، حتى بعد ساعة من الشلل على رقاقة 12. منذ بعض التراكيب الوراثية قد تكون أقل قدرة على التكيف مع الإجهاد في رقاقة، أولا التحقق من هذا النوع من الحيوانات البرية (على سبيل المثال، كانتون S) البقاء على قيد الحياة تقنية الشلل. أ) إن السبب الأكثر شيوعا لتحديد المواقع الفتك هو غير صحيح من يرقة (انظر الأرقام 2G-H). إذا أجزاء من بشرة، الرأس أو القصبة الهوائية ليست بالكامل داخل الغرفة، ثم أنها يمكن أن تتلف خلال الشلل، واليرقة التي هي كبيرة جدا لرقاقة (> 4 مم) هو أقل عرضة للبقاء على قيد الحياة. ب) سبب أقل شيوعا للفتك هو استخدام الكثير من الضغط أو الفراغ عند تحميل رقاقة. عند وضعه بشكل صحيح في الشريحة، والضغط المتولدة عن الفراغ هو جيد التحمل. ولكن الضغط المفرط، إما من فراغ أو في المرحلة الأولية لتحديد المواقع الحيوان يمكن أن يكون مسألة. فمن الأفضل لمعرفة مدى الضغط اللازم تجريبيا عن طريق التجارب مع نوع البرية يرقات الحجم الصحيح. ج) إذا كان يغطي الكثير من النفط الهالوكربون القصبة الهوائية الحيوان الحيوان قد يحتمل أن تكون القضايا مع البقاء على المدى الطويل. النفط يلعب عدة أدوار مهمة في رقاقة: من المهم لخلق الفراغ، والبصريات أثناء التصوير، وأنه يصد جفاف في رقاقة. وينبغي تجنب النفط لكن المفرط. (وهذا يمكن أن يؤدي أيضا إلى النفط في الأنابيب والمحاقن، والمساس الفراغ). المعاطف بروتوكول اقترح فقط الجانب البطنية من يرقة مع النفط، ثم removes النفط الزائد عن طريق وضع اليرقة على ساترة نظيفة قبل أن ينتقل إلى ساترة النهائي للتصوير. د) يمكن أن يكونوا من ذوي الخبرة الضيائية من الدورة التصوير. كما هو الحال مع أي تطبيق التصوير الحي، وهو مثالي للاستخدام مرات التعرض القصير مع انخفاض شدة ضوء الليزر، والذي هو أفضل تحقيق ذلك باستخدام كاميرا حساسة للغاية أو كاشف. محاولة تقليل الإضاءة مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية، بما في ذلك الضوء واسعة الطيف التي أنشأتها مصادر الزئبق ضوء.
قضايا أخرى والاتجاهات المستقبلية:
لأن هذا الأسلوب لا يستخدم التخدير، لا يزال قلب الحيوان للفوز. هذا يخلق بعض التنقل لا مفر منه، مما يؤثر التصوير في بعض المواقع أكثر من غيرهم. توضح الأمثلة هنا أن الحبل البطني العصب والأعصاب قطعي، وجدار الجسم يمكن تصويرها بسهولة دون تدخل من ضربات القلب. في الحالات التي يؤثر على ضربات القلب والتصوير، والحركات العادية يمكن في بعض الأحيان أن تصحح لمعفي برامج التحليل (على سبيل المثال، تثبيت الصورة المساعد ليماغيج). هذا يعمل بشكل جيد عندما تتحرك الأجسام الفردية على نطاق ووقت سريع (على سبيل المثال ~ 1 ميكرون / ثانية لنقل محور عصبي سريع) أو على نطاق الوقت بطيئا جدا (دقائق إلى ساعة). ومع ذلك، عند الكائن (ق) من الخطوة الفائدة مع مجموعة من السرعات والاتجاهات، ويمكن أن يكون من الصعب تصحيح لضربات القلب التي يسببها الحركات.
قضية أخرى هي تقلب طفيف في البصريات من الحيوان الى الحيوان، أو بين جلسات التصوير متعددة من نفس الحيوان في رقاقة. أعمق موضع اهتمام ضمن الحيوانية، وزيادة هذا الاختلاف سيكون. الأعصاب قطعي والحبل البطني العصب عادة ما تكون عميقة جدا داخل ثم الحيوان المراد تصويره على المجهر العادي. ولكن ضغط خفيف من ذوي الخبرة في رقاقة يرقة يدفع هذه الهياكل قريبة جدا للبشرة وساترة. فإن المسافة بالضبط من هذه الهياكل من ساترة لديها اختلافات صغيرة من TRالاتحاد العالمي للتعليم للمحاكمة. الاختلاف لكائنات إغلاق بشرة، مثل الهيئات خلية من الخلايا العصبية الحسية، هو أقل من ذلك. ولذلك فمن المهم، ولا سيما لجعل قياسات كثافة، للاستفادة من عدد كبير من الحيوانات والتجارب المستقلة لحساب التغير في البصريات.
في حين ركزت الأمثلة المعروضة هنا على العمليات داخل الخلايا العصبية، وينبغي أن يكون النهج قابلة للتصوير في أي هيكل الحيوان الذي لا يمكن أن تتحقق داخل العمق مع التركيز على الهدف المجهر. وهذا يشمل بشرة، عضلات جدار الجسم، ولل NMJs بهم. القصبة الهوائية على الجانب البطني للحيوان وربما أجزاء من الجهاز الهضمي ويمكن أيضا تصويرها. ويمكن أيضا وضع الحيوان مع الجانب الظهري تجاه ساترة للتصوير على المدى القصير من الهياكل بالقرب من السطح الظهري. القدرة على هياكل صورة عميقة داخل الحيوان محدودة بسبب المسافة عمل الهدف المجهر المستخدمة. هياكل مثل ايمأقراص aginal لا يمكن الوصول إليها لتضخم عالية (على سبيل المثال 40X) الأهداف.
تم تصميم رقائق يرقة الموصوفة في هذا البروتوكول لليرقات في وقت مبكر 3 المرحلة الثالثة الطور (تتراوح في حجمها 3،5-4 ملم). ولكن العديد من الأسئلة المثيرة للاهتمام تتطلب التصوير في مراحل اليرقات مختلفة. رقائق أصغر لاستيعاب 2 الثانية الطور اليرقات، أو رقائق أكبر لاستيعاب أواخر الطور الثالث 3 ويمكن تصميم بسهولة باستخدام نفس المبدأ. (يحتوي على الشكل التكميلية 1 ملف DXF تعديل بسهولة لصنع قوالب السيليكون مع أحجام غرفة المتغيرة). بل يمكن تطبيق مبدأ بسيط الختم عكسها للكائنات أخرى مثل C. ايليجانس أو الزرد، مع المتغير الرئيسي هو حجم الغرفة. وثمة اتجاه المستقبل هو مفيد لتصميم رقاقة يمكن أن شل العديد من الحيوانات في وقت واحد، لاستخدامها لأغراض الفحص. ومع ذلك، لهذا، فإن التصميم يجب أن يكون مختلفا بشكل ملحوظمن الجهاز الحالي، حيث القضايا لتحديد المواقع الحيوان في رقاقة يحتاج إلى أن تعالج بشكل مستقل لكل حيوان.
سحق فحص الأعصاب لدراسة الاستجابات إصابة في الأعصاب الطرفية اليرقات:
مقايسة سحق العصبية وصفها هنا للأعصاب قطعي اليرقات هي طريقة بسيطة لإدخال اصابة في المحاور الطرفية في ذبابة الفاكهة. مزايا هذه الطريقة ما يلي: أ) أنها بسيطة للقيام مع الأدوات القياسية وجدت في مختبر ذبابة الفاكهة (أ stereomicroscope CO 2 المصدر وملقط)؛ ب) ويمكن إجراء ذلك بسرعة لكثير من الحيوانات، مما يجعل تحليل الكيمياء الحيوية من الحبال العصبية بعد الإصابة 14 ممكنا؛ ج) الاستجابات الجزيئية والخلوية لهذه الاصابة هي تكرار للغاية 14،15،28، ويمكن استخدامها لاكتشاف العمليات التي تعتبر مهمة أيضا في الخلايا العصبية الفقاريات 29،30.
الطرق البديلة لاصابة الخلايا العصبية هو focuسا ليزر عالية الطاقة، على سبيل المثال للأشعة فوق البنفسجية أو نابض ليزر الفيمتو ثانية، بقطع محور عصبي عبر الليزر المجهرية 17،31-33. رقاقة اليرقة هو الأسلوب الأمثل لتحديد المواقع الحيوان لمثل هذه المجهرية. ومع ذلك، وذلك بسبب الاختلافات الطفيفة في البصريات بين التجارب، التي نوقشت أعلاه، يمكن أن الأسلوب القائم على الليزر يكون أكثر صعوبة لإعادة إنتاج اليرقات في، وبخاصة في الأعصاب قطعي اليرقات. أيضا، ليزر مقرها إصابة محور عصبي يتطلب المزيد من الوقت لوضع كل حيوان، وبالتالي هو أكثر صعوبة لإجراء على نطاق واسع (مع وجود عدد كبير من الحيوانات).
استكشاف الأخطاء وإصلاحها:
قضية التقنية واجه الأكثر شيوعا من سحق العصب هو الموت من الأضرار التي لحقت الأجهزة الداخلية. عند إجراء سحق، فمن المهم ألا قرصة الحبل البطني العصب، والغدد اللعابية، أو الأمعاء. من المهم أيضا عدم ثقب بشرة. من الأفضل تجنب هذه القضايا من خلال جلب ملقط في زاوية 45 درجة إلى السطحية بشرةه (انظر الشكل 3).
نوعية ملقط لديه تأثير كبير على فعالية سحق والبقاء على قيد الحياة بعد ذلك. نوصي Dumostar عدد 5 ملقط. للاحتفاظ الحدة، ويجب التعامل مع ملقط الرعاية، لا تستخدم لأغراض أخرى، واستبدالها بمجرد أن تصبح حادة أو عازمة.
يمكن أن حجم الحيوان أيضا التأثير على فعالية سحق. الحيوانات الصغيرة (أقل من 3 ملم في الطول) هي أقل بكثير من المرجح أن تنجو من الاصابة. مع الحيوانات الكبيرة، (3 تجول الطور الثالث)، هو أكثر صعوبة لتحديد موقع الأعصاب وتجنب الأضرار التي لحقت الغدد اللعابية أكبر والأمعاء، وهناك متسع من الوقت لدراسة استجابات أقل إصابة قبل التشرنق. ويجري سحق العصب الأكثر فعالية في وقت مبكر 3 اليرقات طور مرحلي الثالثة (والتي هي 3-4.5 ~ ملم في الطول على طول المحور الأمامي الخلفي).
مصدر الغذاء الذي يظهر على الحيوان قد تؤثر علىقوة بشرة والبقاء على قيد الحياة بعد سحق. فمن المستحسن لرفع الحيوانات في المواد الغذائية المصنوعة من معيار صفة الخميرة الجلوكوز.
أفضل طريقة لتعلم كيفية القيام سحق فعال هو ممارسة على العديد من الحيوانات، أولا مع الهدف الأساسي لتحقيق بقاء (وليس التشرنق) 24 ساعة بعد سحق. مبتدئين وعادة ما يكون معدل البقاء على قيد الحياة منخفض (على سبيل المثال 10٪)، ولكن مرة واحدة وعلم وتقنية، يمكن أن تصل معدلات البقاء على قيد الحياة ~ 90٪.
قضايا أخرى والاتجاهات المستقبلية:
يوفر الفحص سحق وسيلة قوية لدراسة تبرعم محوار الأقرب إلى موقع الإصابة وانحطاط محاور ونقاط الاشتباك العصبي القاصي إلى موقع الإصابة. في حين أن معدلات انحطاط تختلف بين أنواع الخلايا العصبية المختلفة، فهي تكرار للغاية داخل الخلايا العصبية نوع معين، وتوفير دليل على استنساخ لفحص الاصابة.
في المقابل، فإن "التجدد" تنتشراستجابة لوحظ في المحاور الداني هو أكثر تحديا للدراسة. جميع محاور عصبية في العصب قطعي بدء اسعة تنتشر على مقربة من موقع الإصابة (على سبيل المثال، انظر الشكل 6 والشكل 3). ولكن مدى تنتشر يمكن أن تختلف من الخلايا العصبية إلى الخلايا العصبية، ويصعب قياسها كميا. ويمكن ملاحظة درجة مماثلة وتقلبه في تبرعم بعد الآفات البؤرية أكثر من واحد في العصبونات الحركية الأعصاب قطعي قدم باستخدام الأشعة فوق البنفسجية نابض صبغة الليزر. لنا أن نفسر أن يكون الاتجاه nondiscriminate للتبرعم ويرجع ذلك إلى عدم وجود اشارات التوجيه في الأعصاب قطعي. في المقابل، الخلايا العصبية الحسية المحاور أصيب الليزر بالقرب من أجسام الخلايا الخاصة بهم الخضوع لنمو محور عصبي جديد في نفس اتجاه محور عصبي خسر 34. محاور في هذه المنطقة من الحيوان الممكن أن يتعرضوا لمزيد من المعلومات الموضعية محددة لتوجيه محاور تجديد. البيئة داخل الأعصاب قطعي غير المرجح أن يكون الكثير resemblanCE للبيئة أن محاور أبحر أصلا خلال توجيهاتهم في الجنين، وبالتالي ليس من المتوقع الحصول على معلومات لتوجيه محاور تجديد.
قيود أخرى لدراسة تجديد باستخدام قطعي سحق العصبية مقايسة هو أن المصاب محاور عصبية حسية والعصبون الحركي لا تزال لديها مسافة كبيرة لتغطية (0.25-1 ملم) للوصول إلى هدفهم، وإطار زمني محدود (<3 أيام) قبل يمر بها الحيوان التشرنق. وقد حددت دراسة حديثة التلاعب الجيني للمستقبلات هرمون prothoraciotropic التي يتضاعف ثلاث مرات مدة المرحلة 3 اليرقات طور مرحلي الثالثة 35. وهذا التلاعب تمديد الإطار الزمني لدراسة الانتعاش وتنكس الخلايا العصبية بعد الإصابة بشكل ملحوظ، إلى 9 بدلا من 3 أيام. قد يكون هذا لفترة كافية لمراقبة الأحداث الجديدة، مثل إعادة ربط محور عصبي المصابين هدفه بعد المشبكي، وخاصة إذا هو فعل إصابة مقربة من نهاية متشابك.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية، (منحة رقم 0842701 لIOS-CAC)، والمعهد الوطني للصحة (R00MH080599 لBY، R21 NS062313 إلى NC، وNS069844 إلى CAC). نود أن نعترف جيمس شوت، إميلي هان، ويني ترونج للدعم التقني، ومركز الأسهم بلومنجتون لخطوط الطيران. ملفقة جميع رقائق في مرفق Nanofabrication لوري في جامعة ميشيغان.
Materials
| 0.5 mm Polyethylene tubing | Fisher scientific | 14-170-11B | Polyethylene tubing, I.D. = 0.023’’, O.D. = 0.038’’ |
| 1 mm Polyurethane tubing | Fisher scientific | BB521-63 | Polyurethane tubing, I.D. = 0.063’’, O.D. = 0.125’’ |
| barb to barb connector | Bio Rad | 732-8300 | 0.8 mm barb to barb connector |
| 3-way stopcock valve | Bio Rad | 732-8104 | Screw on valve for the syringe |
| Syringe (20 ml) | Fisher scientific | 14-817-33 | Screw on 20 ml syringe for generating vacuum |
| Dispensing needles, 23 G (.4mm I.D., .6mm O.D.) | McMaster-Carr | 75165A684 | Needle for outlet connection |
| Dispensing needles, 21 G, (.6mm I.D., .8mm O.D.) | McMaster-Carr | 75165A679 | Needle for outlet connection |
| Halocarbon oil | Sigma | H8898 | Halocarbon oil 700 |
| Dumostar Number 5 Forceps | Roboz | RS-498 | For nerve crush |
| PDMS Kit (Base and curing agent) | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant 0.5 kg Kit Clear |
| Glass Coverslips | Fisher scientific | 12-544-C | 24 x 40 mm (thickness according to recommendation for your microscope objective) |
| Disposable Plastic Cup (9 oz.) | |||
| Plastic coffee stirrer stick | |||
| Razor Blade | |||
| Grape juice agar plates | See http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925 for recipe |
References
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Gunawardena, S., et al. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
- Miller, K. E., et al. Direct observation demonstrates that Liprin-alpha is required for trafficking of synaptic vesicles. Curr. Biol. 15, 684-689 (2005).
- Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila. Neuron. 22, 719-729 (1999).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
- Schmid, A., et al. Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo. Nat. Neurosci. 11, 659-666 (2008).
- Fuentes-Medel, Y., et al. Glia and muscle sculpt neuromuscular arbors by engulfing destabilized synaptic boutons and shed presynaptic debris. PLoS Biol. 7, (2009).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. . Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. , 476-480 (2012).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance. Anesthesiology. 108, 434-446 (2008).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction. J. Physiol. 558, 489-502 (2004).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12, 372-385 (2011).
- Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. Microfluidic chips for in vivo imaging of cellular responses to neural injury in Drosophila larvae. PloS one. 7, (2012).
- Schmid, A., Sigrist, S. J. Analysis of neuromuscular junctions: histology and in vivo imaging. Methods Mol. Biol. 420, 239-251 (2008).
- Xiong, X., et al. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191, 211-223 (2010).
- Xiong, X., Collins, C. A. A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade. J. Neurosci. 32, 610-615 (2012).
- Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo Laser Axotomy in C. elegans. J. Vis. Exp. (51), (2011).
- Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans. J. Vis. Exp. (57), (2011).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2. 2, 2024-2032 (2007).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24, 461-465 (2006).
- Rao, S., Lang, C., Levitan, E. S., Deitcher, D. L. Visualization of neuropeptide expression, transport, and exocytosis in Drosophila melanogaster. J. Neurobiol. 49, 159-172 (2001).
- Fujioka, M., et al. Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila. Development. 130, 5385-5400 (2003).
- Rietdorf, J., Steitz, A., Heidelberg, E. Linear unmixing macro for ImageJ. European Advanced Light Microscopy Network. , (2004).
- Koon, A. C., et al. Autoregulatory and paracrine control of synaptic and behavioral plasticity by octopaminergic signaling. Nat. Neurosci. 14, 190-199 (2011).
- Yarali, A., Gerber, B. A Neurogenetic Dissociation between Punishment-, Reward-, and Relief-Learning in Drosophila. Front. Behav. Neurosci. 4, (2010).
- Kuo, C. T., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Dendrite-specific remodeling of Drosophila sensory neurons requires matrix metalloproteases, ubiquitin-proteasome, and ecdysone signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15230-15235 (2005).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- Xiong, X., et al. The highwire ubiquitin ligase promotes axonal degeneration by tuning levels of nmnat protein. PLoS Biol. 10, (2012).
- Shin, J. E., et al. Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration. Neuron. 74, 1015-1022 (2012).
- Watkins, T. A., et al. DLK initiates a transcriptional program that couples apoptotic and regenerative responses to axonal injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 4039-4044 (2013).
- Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway. Science. 323, 802-806 (2009).
- Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nat. Methods. 5, 531-533 (2008).
- O’Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (24), (2009).
- Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite. Mol. Biol. Cell. 21, 767-777 (2010).
- Miller, D. L., Ballard, S. L., Ganetzky, B. Analysis of synaptic growth and function in Drosophila with an extended larval stage. J. Neurosci. 32, 13776-13786 (2012).
